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后猛等 , 2011, 甘薯 IbSPF1 基因植物表达载体的构建 , 分子植物育种 Vol.9 No.82 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0082)
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特 有 的 转 录 调 节 因 子 ， 因 在 N- 端 含 有 由
WRKYGQK 组成的高度保守的氨基酸序列而得名。
目前，人们已从多种植物中分离出该家族的成员，
并对其生理特性进行深入研究 (Chen and Chen,
2000; Sun et al., 2003; Lagace and Matton, 2004;
Zhang et al., 2004; Xu et al., 2004; Borrone et al.,
2004; Ashida et al., 2002; Lambais, 2001; Pnueli et al.,
2002)。WRKY 蛋白能专一性结合((T) (T) TGAC
(C/T)序列，而这种结合特定 DNA 序列的功能是由
WRKY 蛋白中的 WRKY 结构域行使的(Eulgem et
al., 1999)。研究表明，WRKY 蛋白广泛地参与植物
对生物、非生物胁迫的应答反应、植物衰老和器官
发育等一系列生理活动，在植物的抗逆境反应中起
着非常重要的作用。
虽然 IbSPF1 是第一个从植物中克隆得到的
WRKY 超家族成员 (Ishiguro and Nakamura, 1994)，
但是其生物学功能一直没有得到深入了解。本实验
以日本甘薯品种‘Kokei No.14’总 RNA 为模板，成
功地克隆了 IbSPF1 基因 cDNA，构建起含有不同启
动子(CaMV 35S 和 SWPA2)的 IbSPF1 基因植物表达
载体，对进一步研究 IbSPF1 基因的生物特性以及
转基因甘薯的抗逆性有重要意义，并为抗逆植物基
因工程的进一步研究提供参考。
1 结果与分析
1.1 IbSPF1 基因的克隆及序列测定
参照 Ishiguro 和 Nakamura (1994)报道的甘薯基
因 cDNA 序列，设计一对基因特异性引物(GSP, 由
韩 国 SolGent 公 司 合 成 ) ， IbSPF1-Forward ：
5’- GGATCCATGGCTGCTTCT TCAGGGACAATA
-3’( 下 划 线 部 分 为 BamHⅠ 酶 切 位 点 ) ；
IbSPF1-Reverse：5’– GGATCCTCAAGCTAGCAAT
GTGTCCAGAAA-3’( 下划线部分为 Bam HⅠ酶切
位点)。按照以上设计引物对 IbSPF1 基因进行 PCR
扩增，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物显示一
条 1.7 kb 左右长度的 DNA 片段( 图 1)，该产物经凝
胶回收试剂盒回收克隆到 T-Blunt 载体上，转至大
肠杆菌 DH5α。挑取 4 个阳性克隆用碱裂解法提取
质粒，BamHⅠ酶切后，编号为 2、3 和 4 的克隆均
可扩增出预期的目的片段( 图 2)。测序结果表明，3
号克隆序列与 NCBI 上登录的序列仅有一个核苷酸
差异(图 3)，相似度高达 99.99%。
图 1 RT-PCR 扩增结果
注 : M: 分子量 Marker; 1: 以 Oligo (dT)为引物所得 PCR 产
物; 2: 以 GSP 为引物所得 PCR 产物
Figure 1 RT-PCR amplification of IbSPF1 cDNA
Note: M: Marker; 1: The PCR product with Oligo (dT) primer;
2: The PCR product with GSP primer
图 2 重组质粒 T-Blunt-IbSPF1 酶切检测
注: M: 分子量 Marker; 1~4: 质粒酶切结果
Figure 2 Detection of remodeled plasmid T-Blunt- IbSPF1
digested with BamHI
Note: M: Marker; 1~4: The results of plasmid digested with
restriction endonuclease
1.2 植物表达载体的构建与鉴定
将 IbSPF1 基因分别与质粒 pCAMBIA2300- C-
aMV 35S 和 pCAMBIA2300- SWPA2 连接后得到单
克隆，用引物对 1(CaMV 35S int-For 和 IbSPF1-Rev-
erse) 和 引 物 对 2 (SWPA2 c-term-For 和
IbSPF1-Reverse)进行克隆 PCR 检测，以鉴定 IbSPF1
片段与 pCAMBIA2300-CaMV 35S 或 pCAMBIA2300
-SWPA2 的连接方向的正确性。在挑取的 7 个
pCAMBIA2300-CaMV 35S-IbSPF1 阳性克隆中共有
2 个克隆得到了预期的目的片段 (图 4)，表明编号分
别为 4 和 8 的克隆连接方向正确；在挑取的 5 个