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李红艳等
, 2011,
落叶松总
DNA
的提取及
ISSR-PCR
引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.77 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0077)
1567
图
2
引物
807, 809, 818, 849
对
1~10
号样品扩增结果
Figure 2 Electrophoresis of 1~10 samples by primer 807, 809, 818, 849
2.2 ISSR
引物的筛选
试验以改进
CTAB
法提取的落叶松
DNA
为模
板，对
50
条引物进行了筛选，共筛选出
8
条条带
清晰、多态性丰富、重复性好的引物。通过引物的
适合筛选，可以应用
ISSR
标记技术进行落叶松育
种早期鉴定，为缩短育种年限、提高育种效率提供
可能；可以快速、准确地分析落叶松不同群体之间
以及同一群体内不同种质材料的遗传多样性水平
和遗传分化程度，明确其亲缘关系，从而为落叶松
种质资源鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助育种
和基因工程等研究领域提供分子生物学依据。
3
材料与方法
3.1
材料
3.1.1
试验材料
供试材料为落叶松当年生新梢，
2009
年
6
月采
自黑龙江省林口县青山林场，置于冰上带回实验
室，保存于超低温
(
-
70
℃
)
冰箱中。
3.1.2
主要药品及试剂
(1)CTAB
抽提缓冲液：
2% CTAB(m/v)
，
100
mmol/L Tris-HCl (pH8.0)
，
1.5 mol/L NaCl
，
20
mmol/L EDTA
；
(2)TE
：
10 mmol/L Tris-HCl
；
1.0
mmol/L EDTA
；
(3)
氯仿：异戊醇
=24:1
；
(4)β-
巯基
乙醇，
TAE
电泳缓冲液、琼脂糖、
EB
等。所用药
品均为国产分析纯。
(5)ISSR
引物由上海生工
(Sangon)
合成，用于
ISSR-PCR
反应的
Taq
酶、
dNTP
以及
DL 2000
均为
TaKaRa
公司生产。
3.2
方法
3.2.1 DNA
的提取
用改进的
CTAB
法提取材料的总
DNA
。具体
步骤如下：
①
在
1.5 mL
无菌离心管中加
700 μL CTAB
裂
解液和
20 μL
的
β
-巯基乙醇，
65
℃
浴热
10 min
。
②
从-
70
℃
冰箱中取出材料后用研钵加液氮和
石英砂研磨成粉末状，向步骤
①
中的每个离心管中
加约
0.04 g
，颠倒均匀，
65
℃
恒温水浴
30 min
，其
间定时温和摇匀。
③
溶液冷至室温，加入
700 μL
的氯仿-异戊醇
(24:1)
，轻轻振荡
10 min
。
12 000 r/min
④
离心
10 min
，取上清，加入氯
仿-异戊醇，重复抽提
2
次。
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