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李红艳等
, 2011,
落叶松总
DNA
的提取及
ISSR-PCR
引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.77 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0077)
1566
有过多的样品残留
(
图
1)
，说明提取的
DNA
质量较
高，完整性较好，没有较多的蛋白质等污染。紫外
分光光度检测
OD
260
/
OD
280
值在
1.75~1.95
之间，表
明
DNA
样品纯度较高，可用于
ISSR
引物的筛选分
析和其他相关试验。
图
1
部分样品基因组
DNA
电泳结果
注
: 1~6
号泳道分别为
1~6
号样品
Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA
Note: Lane 1~6: Sample 1 to sample 6
1.2
引物筛选
采用已知的落叶松
ISSR-PCR
的最适反应体系
(
林萍等
, 2005)
，从
50
条引物中筛选出
8
条有效引
物
(
表
1)
，其扩增条带清晰、稳定、重复性好、多态
性丰富。
1.3
样品扩增
采用已知的落叶松
ISSR-PCR
的最适反应体系
和筛选出的
8
条引物对林口青山的
1~10
号样品进
行扩增，可见扩增条带清晰可辨，多态性丰富，差
异明显
(
图
2)
，说明本实验提取的
DNA
和引物筛选
的质量较好，可以进行种质鉴定、遗传多样性分析
等方面的研究。
2
讨论
2.1 DNA
提取方法改进
高纯度、高产率的基因组总
DNA
是分子生物
学实验关键的第一步。不同的植物，提取的方法各
异，对于同一植物，不同实验室所用仪器、试剂不
同，提取方法也不尽相同。在实际应用中，要进行
适当的改进方能获得较纯的产物。
DNA
的提取质量
受许多因素影响，在提取基因组
DNA
过程中，各
步骤微小的改变都能产生明显的效果。我们针对落
叶松针叶不易磨碎、富含多酚、多糖、色素及蛋白
质的特点，在
CTAB
法的基础上通过增加以下步骤
提取总
DNA
。①在研磨时加入石英砂，可使液氮研
磨针叶时能够尽可能地磨碎，保证其充分裂解；②
向提取液中加入抗氧化剂
β-
巯基乙醇，可有效防止
提取过程中材料与氧接触，自发氧化褐变或在多酚
氧化酶
(PPO)
作用下发生酶促褐变，生成褐色的醌
类物质等；③利用在乙醇的盐溶液中
DNA
的沉淀
速度远远大于色素、多糖和酚类等其它物质的原
理，在用无水乙醇沉淀
DNA
时加入低浓度乙酸钠，
这样进一步去除了多糖、色素等其它杂质；④
DNA
沉淀后用
RNase
消化，排除了
RNA
的干扰。这种
方法提取的
DNA
初提物呈白色，纯化后没有褐化
现象，收率得以提高，经
0.8%
凝胶电泳和紫外分光
光度计检测，
DNA
的质量和纯度都较好。
表
1
筛选出的
8
条
ISSR
引物
Table 1 Selected eight ISSR primers
引物代码
Primer
引物序列
(5'-3')
Sequence (5'-3')
总谱带数
Total
多态性谱带数
Variable
UBC807
AGAGAGAGAGAGAGAGT
7
6
UBC809
AGAGAGAGAGAGAGAGG
8
7
UBC818
CACACACACACACACAG
8
8
UBC826
ACACACACACACACACC
6
4
UBC827
ACACACACACACACACG
5
4
UBC834
AGAGAGAGAGAGAGAGYT
7
6
UBC849
GTGTGTGTGTGTGTGTYA
9
9
UBC856
ACACACACACACACACYA
8
8