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李红艳等
, 2011,
落叶松总
DNA
的提取及
ISSR-PCR
引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.77 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0077)
1568
⑤
将上清中加入
3
滴
3 mol/L
醋酸钠和
700 μL
无水乙醇，沉淀
30 min
，
12000 r/min
离心
15 min
，
弃上清。
⑥
在沉淀中加入
75%
的乙醇
700 μL
清洗沉淀
2
次，
12 000 r/min
离心
30 s
后轻轻倒去乙醇。
⑦
室温自然干燥离心管内的
DNA
沉淀，加入
50 μL TE
，使
DNA
充分溶解。
⑧
加入
2~3 μL RNase (10 μg/μL)
，
5 μL
10×Buffer
，
37
℃
下
1~2 h
。
⑨
加入等体积氯仿，
12 000 r/min
离心
5 min
，
取上清，加入
3
倍体积无水乙醇，混匀，
12 000 r/min
离心
15 min
，弃上清。
⑩
室温气干，加入
30 uL
灭菌的去离子水，使
DNA
充分溶解。
3.2.2 DNA
质量、纯度检测
取
2 μL
模板
DNA
在
0.8%
的琼脂糖凝胶中，于
5 V/cm
电压下电泳，检测总
DNA
的质量。利用
Eppendorf
紫外分光光度计
(
德国
)
测定
DNA
纯度和
含量，以
OD
260
值计算总
DNA
浓度，以
OD
260
/
OD
280
值判断总
DNA
的纯度。
3.2.3
引物筛选方法
参照哥伦比亚大学公布的
ISSR
引物序列合成
一系列引物，用林萍优化的落叶松
ISSR-PCR
反应
体系
(
林萍等
, 2005)
分别进行扩增，从中筛选合适的
引物。供试的
ISSR
引物序列情况见
(
表
2)
。
表
2
试验所用引物及序列
Table 2 Primers and sequence
引物代码
Pprimers
碱基序列
(5'-3')
Sequence (5'-3')
引物代码
Primers
碱基序列
(5'-3')
Sequence (5'-3')
UBC803
ATATATATATATATATC
UBC835
AGAGAGAGAGAGAGAGYC
UBC804
TATATATATATATATAA
UBC836
AGAGAGAGAGAGAGAGYA
UBC805
TATATATATATATATAC
UBC838
TATATATATATATATARC
UBC807
AGAGAGAGAGAG AGAGT
UBC839
TATATATATATATATARG
UBC808
AGAGAGAGAGAGAGAGC
UBC841
GAGAGAGAGAGAGAGAYC
UBC809
AGAGAGAGAGAGAGAGG
UBC843
CTCTCTCTCTCTCTCTRA
UBC810
GAGAGAGAGAGAGAGAT
UBC844
CTC TCT CTC TCT CTC TRC
UBC811
GAGAGAGAGAGAGAGAC
UBC845
CTCTCTCTCTCTCTCTRG
UBC812
GAGAGAGAGAGAGAGAA
UBC848
CAC ACA CAC ACA CAC ARG
UBC813
CTCTCTCTCTCTCTCTT
UBC849
GTG TGT GTG TGT GTG TYA
UBC814
CTCTCTCTCTCTCTCTA
UBC852
TCTCTCTCTCTCTCTCRA
UBC815
CTCTCTCTCTCTCTCTG
UBC853
TCTCTCTCTCTCTCTCRT
UBC818
CACACACACACACACAG
UBC854
TCTCTCTCTCTCTCTCRG
UBC819
GTGTGTGTG TGTGTGTA
UBC855
ACACACACACACACACYT
UBC820
GTGTGTGTGTGTGTGTC
UBC856
ACACACACACACACACYA
UBC821
GTGTGTGTGTGTGTGTT
UBC858
TGTGTGTGTGTGTGTGRT
UBC822
TCTCTCTCTCTCTCTCA
UBC859
TGT GTG TGT GTG TGT GRC
UBC823
TCTCTCTCTCTCTCTCC
UBC861
ACCACCACCACCACCACC
UBC824
TCT CTC TCT CTC TCT CG
UBC862
AGCAGCAGCAGCAGCAGC
UBC826
ACACACACACACACACC
UBC869
GTT GTT GTT GTT GTT GTT
UBC827
ACACACACACACACACG
UBC872
GATAGATAGATAGATA
UBC828
TGTGTG TGTGTGTGTGA
UBC873
GACAGACAGACAGACA
UBC829
TGTGTG TGTGTG TGTGC
UBC878
GGATGGATGGATGGAT
UBC833
ATATATATATATATATYG
UBC882
VBVATATATATATATAT
UBC834
AGAGAGAGAGAGAGAGYT
UBC884
HBHAGAGAGAGAGAGAG