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陈罡等 , 2011, 美国白蜡 SRAP-PCR 反应体系的建立与优化, 分子植物育种 Vol.9 No.74 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0074)
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扩增体系是可行的。选用的 8 对引物组合均能在 4
个材料中扩增出多态性条带，且多态性位点丰富，
说明 SRAP 标记适合用于美国白蜡品种的遗传多样
性分析及分子鉴定。
图 9 8 对引物组合在 4 个不同种源美国白蜡材料中扩增出的
SRAP 条带
Figure 9 SRAP fragment amplified by primer combination in
different material Fraxinus americana
2 讨论
美国白蜡生长速度快，绿化效果好，是沿海湿
地造林的优良树种之一。因其抗逆性强，具有优良
的抗逆基因资源，是进行林木抗性育种研究的理想
材料。由于美国白蜡遗传基础材料匮乏，并且为多
年生木本植物、世代周期长、遗传高度复杂等原因，
利用传统林木遗传育种的方法难以在分子水平上
揭示其遗传基础。DNA 分子标记技术是直接对其
DNA 进行研究，不受环境和发育阶段的影响，更具
目的性和高效性，是对其进行遗传图谱构建、不同
品种遗传多样性分析、良种鉴定及抗性基因定位等
研究的有力工具。
SRAP 标记是目前一种较为理想的分子标记技
术，与其他常用的分子标记相比，弥补了它们的一
些不足，而且更能反应表型的多样性及进化史
(Ferriol et al., 2003a, 2003b)，提供的信息也更为优
良(Ferriol et al., 2004)。 SRAP 标记引物通用性强，
不需要预知物种的序列信息，因此应用广泛。目前，
已经在蔬菜作物、果树等多种植物的遗传育种研究
中成功应用，在林木指纹图谱建立( 王宇等, 2007,
林业实用技术, (5): 3-5)、种质鉴定(於朝广等, 2009)
及林木遗传多样性分析( 陈罡等 , 2010; 王骞春等,
2010, 辽宁林业科技, (6): 19-21, 48)等方面研究也
已陆续开展，本试验首次对美国白蜡的 SRAP-PCR
扩增体系进行优化，建立的扩增体系稳定可靠，能
够很好的用于美国白蜡分子遗传育种研究。
由于 SRAP 标记是一种基于 PCR 的分子标记技
术，扩增结果受反应条件、材料、药品及仪器不同
等因素的影响，因此在应用前应对其扩增体系进行
优化，根据实际所用进行调整。SRAP 体系优化的
方法有多种，本试验对其反应体系中 5 个因素进行
正交设计，得到了美国白蜡 SRAP-PCR 的最佳扩增
体系，试验快捷简便，结果科学可靠。但该方法也
存在一定局限性，在对扩增谱带的优劣判断上带有
一定的主观成分，不能很好地说明各因素间的互作
等，如果能够建立客观的 PCR 扩增结果评价标准，
则能极大的促进以 PCR 技术为基础的分子标记技
术的应用。
3 材料与方法
3.1 试验材料
供试材料为辽宁省林业科学研究院从美国引
进不同种源的美国白蜡成熟饱满种子，经组培扩繁
获得实生苗后，剪取其幼嫩叶片-70℃保存备用。
3.2 基因组 DNA 提取
采用 CTAB 法并略加改进后提取基因组 DNA。
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA 的质量及完整
性，并用 UV1102 紫外分光光度计测定其浓度，选
出适宜的作为模板 DNA，稀释至所需浓度后，-20℃
保存备用。
3.3 引物筛选
SRAP 引物采用已发表 (Li and Quiros, 2001)的
引物组合，由北京赛百胜生物公司合成。随机选取
16 对引物组合，参考 Li 和 Quiros 的扩增反应体系
及程序，进行引物筛选，选择条带丰富清晰的引物
组合进行优化实验。
3.4 SRAP-PCR 反应体系及扩增条件
采用正交设计确定 PCR 反应中 5 个因素(Mg 2+,
dNTP, 引物, Taq DNA 聚合酶及模板 DNA)的最佳
水平，正交设计方案( 表 1)。随机选取一个模板按表
1 中的 16 个处理进行实验，每处理重复 2 次。扩增
反应均在 PTC-200 型 PCR 仪(BIO-RAD)上进行。反
应总体系为 25 μL ，扩增程序首先是 94 ℃预变性 5
min ；然后前 5 个循环为：94℃变性 30 s，37℃退