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陈罡等
, 2011,
美国白蜡
SRAP-PCR
反应体系的建立与优化
,
分子植物育种
Vol.9 No.74 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0074)
1540
1.1
美国白蜡基因组
DNA
的提取及浓度检测
采用改良的
CTAB
法
(
钟鸣等
, 2002)
对美国白
蜡基因组
DNA
进行提取，利用紫外分光光度计及
1%
琼脂糖凝胶电泳检测其浓度及质量，电泳结果图
中电泳条带清晰完整
(
图
1)
，所得的
DNA
质量较高，
能够完全满足后续的实验要求。经过稀释使其浓度
在
20 ng/
μ
L
左右。
图
1 1%
琼脂糖检测基因组
DNA
注
: A: M: λDNA/
Hin
d
Ⅲ
marker; 1~8:
美国白蜡基因组
DNA;
B: 1~5: λDNA,
从左到右分别为
15 ng, 30 ng, 60 ng, 90 ng,
150 ng; 6~15:
稀释后的
DNA
Figure 1 The total DNA isolates checked by 1% Agrose gel
Note: A: M: λDNA/
Hin
d
Ⅲ
marker; 1~8: The total DNA of
Fraxinus Americana; B: 1~5: λDNA, from left to right, 15 ng,
30 ng, 60 ng, 90 ng, 150 ng; 6~15: 20 ng/μL dilution
1.2
引物筛选
同一模板
DNA
，
16
个不同引物组合对其扩增
条带的多少和清晰度都不同，有的引物组合能够扩
增出清晰、丰富的条带，有的引物组合扩增的条带
较少、模糊
(
图
2)
。因此，在
SRAP-PCR
反应中，
图
2
不用引物组合对扩增结果的影响
注
: M: DL2000 marker; 1~16: 16
个
SRAP
引物组合
Figure 2 The influence of different match primers on amplified
products
Note: M: DL 2000 marker; 1~16: 16 different match primers
combination
应通过不同的引物组合，筛选条带丰富、清晰的引
物作为扩增引物。
1.3
正交试验电泳结果分析
按表
1
设计的
16
个处理进行
PCR
扩增后，产
物用
1.2%
琼脂糖凝胶电泳检测
(
图
3)
，根据条带数
量丰富度、扩增条带敏感性与特异性进行打分
(
何正
文等
, 1998)
，即背景深、条带多且清晰的记
16
分，
反之记为
1
分。从两次分别独立的打分结果来看，
两个重复统计比较一致。通过统计分析，求出各水
平的均值
T1
、
T2
、
T3
、
T4
和各因素的极差
R
值。
结果表明：各因素水平变化对
PCR
反应的影响均较
大，其中
Mg
2+
浓度对扩增结果的影响最大，引物浓
度影响最小。
图
3 SRAP-PCR
正交试验设计
PCR
电泳
注
: M: DL 2000 marker; 1~16:
处理编号
(
表
1)
Figure 3 The result of SRAP-PCR products electrophoresis by
orthogonal design
Note: M: DL 2000 marker; 1~16: The treatments as showed in
table 1
1.4 Mg
2+
浓度对
SRAP
扩增结果的影响
从
Mg2+
浓度与
PCR
评分结果关系来看，
Mg
2+
浓度各水平间均达到显著水平，说明
Mg
2+
浓度对
PCR
结果的影响较大
(
图
4)
。研究表明，
Mg
2+
浓度
对
PCR
扩增的产量和特异性有显著的影响，当
Mg
2+
浓度过低时，会降低
Taq
DNA
聚合酶活性，使反应
产物减少；浓度过高时，反应特异性降低，则产生
非特异性扩增。本实验结果
1.5 mmol/L~2.0 mmol/L
范围内结果均值随
Mg
2+
浓度的增加而下降，这可能
是由于反应各因素的共同作用等原因所致。因此，
选择
2.5 mmol/L
为最佳浓度水平。