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施涯邻等
, 2011,
高质量木薯根
,
茎
,
叶总
RNA
和总蛋白样品的制备方法
,
分子植物育种
Vol.9 No.67 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0067)
1494
图
2
木薯各组织总蛋白的双向电泳检测
注
:
等点聚焦电泳采用
24 cm, pH 4~7
干胶条
,
上样量为
400 µg
总蛋白
; A:
叶
; B:
茎
; C:
块根
Figure 2 2
-
DE analysis of protein isolated from different
tissues of cassava
Note: A 24 cm-IPG gel strip with pH range of 4~7 was used in
isoelectric focusing electrophoresis, Loading amount was 400 µg
of protein; A: leaf; B: stem; C: storage root
2010)
。另一种常用的蛋白质提取方法是将样品组织
溶解于
Tris
-饱和酚中，再用含醋酸铵的甲醇溶液进
行沉淀。这种方法在上世纪
80
年代发展起来
(Hurkman
and Tanaka, 1986; Schuster and Davies, 1983)
，适用
的植物范围比较广泛，并在使用过程中得到了一定
程度的改进
(Isaacson et al., 2006; Saravanan and Rose,
2004)
。酚法的缺点在于步骤比较繁琐，蛋白质的损
失较大。目前，对于成分较为复杂的植物样品，提
取方法趋于多样化
(Carpentier et al., 2005; Saravanan
and Rose, 2004; Wang et al., 2003)
。
本研究从适合双向电泳技术的蛋白提取方法
入手，对传统的
TCA
丙酮法进行优化。植物样品液
氮研磨破碎后，先加入
SDS
提取缓冲液，使蛋白质
溶解在缓冲液中，大部分杂质通过离心沉淀下来。
研磨的同时加入
2%
的
PVPP
，除去了多酚类物质，
防止蛋白氧化导致的质量下降。从双向电泳结果可
以看出，凝胶背景清晰，蛋白质点聚焦充分，重复
性良好。
SDS
提取缓冲液和传统的
TCA
丙酮法相结
合，不仅保持了较高的蛋白质提取效率，而且最大
限度的提高了样品质量，为木薯差异蛋白组学的研
究打下了基础。
3
材料与方法
3.1
实验材料
实验用木薯
(Manihot esculenta Crantz)
种植于
广西大学农场。收集华南
124
块根膨大期的块根、
茎、叶，清理干净后用液氮速冻并分装保存于
-
80
℃。
3.2
仪器与试剂
LiCl
，氯仿，乙二胺四乙酸钠
(EDTA)
，甘油，
三氯醋酸
(TCA)
，
β-
巯基乙醇
(β
-
ME)
，交联聚乙烯
基吡咯烷酮
(PVPP)
，丙酮，均为国产分析纯。水饱
和酚，
3
-
[(3
-胆固醇氨丙基
)
二甲基氨基
]
-
1
-丙磺酸
(CHAPS)
，十二烷基硫酸钠
(SDS)
，购自
Solarbio
公
司；硫脲，尿素，
Tris
，购自
Bio Basic
公司；焦碳
酸二乙酯
(DEPC)
，二硫苏糖醇
(DTT)
，购自
Merck
公司；
IPG
胶条，覆盖油，
2
-
D Clean-Up Kit
购自
GE
公司。
主要设备：
BECKMAN COULTER DU 730
核酸
蛋白分析仪，
HITACHI himac CF 16RX
离心机，
NanoDrop ND
-
1000
微量分光光度计，
BECKMAN
COULTER J2
-
MC
离心机，
Ettan IPGphor
等电聚焦
系统，
Ettan DALTsix
大型垂直电泳系统。
3.3
木薯总
RNA
提取
(1)
取
6 mL RNA
提取缓冲液
(100 mmol/L LiCl,