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施涯邻等
, 2011,
高质量木薯根
,
茎
,
叶总
RNA
和总蛋白样品的制备方法
,
分子植物育种
Vol.9 No.67 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0067)
1493
植物蛋白提取已经建立了很多方法
(Rabilloud,
1996)
，选择适合的方法进行组合依赖于所提取的材
料性质及应用目的。开展木薯转录组学和蛋白组学
研究，首先需要获得高质量的木薯
RNA
和蛋白质。
针对这个问题，本研究对用于构建木薯
cDNA
文库
的各器官总
RNA
制备方法和适合于双向电泳的总
蛋白制备方法进行了摸索。
1
结果与分析
1.1
木薯各器官总
RNA
的制备及其质量分析
采用本文报道的方法提取的木薯块根、茎和叶
的总
RNA
，在
0.8%
的琼脂糖凝胶电泳后，呈现非常
清晰的
28S
和
l8S rRNA
带型及微量的
5S rRNA
条带，
没有降解及拖尾现象
(
图
1)
，
A
260
/A
280
在
1.90~1.98
(
表
1)
，表明
RNA
质量很高。样品中微量的
DNA
可
图
1
木薯各组织总
RNA
的电泳检测
注
: A:
叶
; B:
茎
; C:
块根
Figure l Electrophoretic analysis of RNA isolated from
different tissues of cassava
Note: A: leaf; B: stem; C: storage root
表
1
木薯各组织提取的
RNA
吸光度比值和产率
Table l Absorbance ratios and yields of RNA isolated from
different tissues of cassava
组织
吸光度比值
A
260
/A
280
产率
(µg/g FW)*
Tissue
Absorbance ratio A
260
/A
280
Yield (µg/g FW)*
叶
1.90
90
leaf
茎
1.98
70
stem
块根
1.92
65
storage root
注
: *FW=
鲜重
Note: *FW=Fresh Weight
以通过使用
mRNA
分离试剂盒而完全去除。从不同
组织得到的
RNA
产率为
65~90 µg
每克鲜组织，其中
叶的产率最高，块根的产率最低。
1.2
木薯各器官总蛋白质的制备及其质量分析
对提取的木薯叶、茎和块根的总蛋白，经
GE
Healthcare 2
-
D Clean-Up Kit
试剂盒处理后，可得到
很好的双向电泳结果
(
图
2)
。每可组织的蛋白得率分
别为：叶
5 mg
，茎
0.6 mg
，块根
0.5 mg
。
2
讨论
早期常用的
RNA
提取方法
(Chirgwin et al., 1979)
能够有效地将
RNA
从
DNA
中分离出来，但是这种提
取方法耗时长，而且需要进行超速离心，给研究工
作带来了很大不便。随后发展起来的酸性异硫氰酸
胍-酚-氯仿的一步
RNA
提取法
(Chomczynski and
Sacchi, 1987)
，不需要超速离心，但是由于木薯组
织的成分复杂，异硫氰酸胍-酚-氯仿法在我们的前
期实验中证明不适合提取木薯总
RNA
。
本研究使用的
RNA
提取缓冲液配方参考了报
道过的配方
(Sripati et al., 1976)
，根据实际情况做了
一定调整。从电泳结果
(
图
1)
可以看出，所获得的总
RNA
的
28S
和
18S rRNA
条带清晰，没有弥散拖尾现
象出现，说明
RNA
没有降解，且大部分杂质已经除
去。虽然木薯根、茎、叶的总
RNA
中还有微量
DNA
残留，导致
A
260
/A
280
的比例略低，但这很容易通过
其他方法去除
(
例如常用的
mRNA
试剂盒
)
。同时
5S
rRNA
条带含量较少，这与已有报道
(Cathala et al.,
1983)
的
LiCl
沉淀法容易导致
tRNA
、
5S rRNA
和
snRNA
等小
RNA
产量偏低的现象完全相符，但并不
影响
mRNA
的得率。由于构建
cDNA
文库前，首先
要进行
mRNA
的分离，在纯化
mRNA
的同时可以很
好的将基因组
DNA
除去，因此样品中微量的
DNA
污染在反转录前就可以去除干净。目前，用本方法
制备的块根膨大期的木薯品种华南
124
和辐选
01
的
叶、茎和块根的总
RNA
，已被成功用于
cDNA
文库
的构建和新一代测序仪的转录组分析。
基于
TCA
-丙酮的蛋白质沉淀法是总蛋白提取
最常用的方法之一
(Damerval et al., 1986; Gorg et al.,
1988, Santoni et al., 1994)
。本实验室采用这种方法
提取植物病原真菌——板栗疫病菌的总蛋白样品，
在保证质量的前提下，产率也相对较高
(
王金子等
,