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郭修武等
, 2011,
应用
SRAP
分子标记技术鉴定葡萄种间杂交后代
,
分子植物育种
Vol.9 No.52 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0052)
1391
‘
红地球
×
双优
’
后代中的鉴定结果，经重复试验，结
果可靠。对鉴定后的
87
株个体进行了田间形态学
观察，在叶片、枝条特征等方面表现出明显的父本
特征，表明这些单株为红地球
×
双优的种间杂种。
图
3
引物组合
Me8eM5
对杂交后代的鉴定
注
: 1~94
为杂交后代群体
;
表示父本特异带
Figure 3 Identification of crossing progenies by primer
combination Me8Em5
Note: Number 1~94 were cross progenies; Means Specific
bands from male parent
2
讨论
由于杂交育种工作的长期性，尤其在木本植物
当中，育种周期可长达十几年，对杂交种后代的早
期鉴定就显得尤为重要
(
钟淮钦等
, 2005)
。常规的杂
种鉴定方法有形态学鉴定、细胞学鉴定、孢粉学鉴
定和同工酶鉴定等，但由于材料本身的特点，及技
术方法中存在的问题，使这些方法在实际的应用中
受到很大的限制。与上述几种鉴定方法相比
, DNA
分子标记具有标记数量巨大，无器官、组织及发育
特异性
,
不受任何环境因素影响
,
完全遵守简单的
孟德尔式遗传且有体细胞稳定性等优点
(
郑成超和
温孚江
, 1997)
。尤其是随着近年来分子标记技术和
方法的飞速发展，已经成为植物杂种鉴定研究的有
效工具。
Li
等
(Li and Quiros, 2001)
开发的
SRAP
分
子标记技术，针对基因组中的
ORF
区域进行扩增，
体现了物种间基因的多态性，检测结果更能体现出
个体间真实的亲缘关系。
由于
SRAP
标记或为显性标记或为共显性标
记，在双亲中进行引物筛选时无法判断具有父本特
异带的位点的类型是纯和显性位点还是杂合显性
位点。故需要结合
3~5
个
SRAP
标记进行综合分析。
在后代中出现分离的父本特征带则可判断位点的
基因型为
Aa
，全部后代显现父本特征带则为
AA
。
如采用具有父本特征的纯和显性标记进行真假杂
种鉴定，只需要通过一对引物就可以对所有杂交后
代的真实性进行鉴定
(
乔燕春和林顺权
, 2010)
。本试
验中鉴定
‘
红地球
×
双优
’
种间杂种时采用了
5
个父
本特异标记，虽然这些标记均为杂合的显性标记，
但是由于
SRAP
标记的谱带丰富、多态性高的特点，
在杂种鉴定中很容易获得足够多的父本标记。
利用
SRAP
分子标记技术，对葡萄
‘
红地球
×
双
优
’
种间杂交组合的
94
株实生苗进行了早期杂种鉴
定。从
80
对
SRAP
引物中筛选出
5
对具有父本特
征带的引物，共鉴定
94
株中的
87
株为真杂种。研
究结果表明
SRAP
技术可有效的用于葡萄杂交后代
的真实性鉴定及相关研究中。
3
材料与方法
3.1
试验材料
试验于
2009
年
6
月
-2010
年
9
月在沈阳农业大
学果树分子生物学实验室进行。试验材料为欧亚种
葡萄
(
Vitis vinifera
)
品种
‘
红地球
’
、山葡萄
(
Vitis
amurensis
)
品种
‘
双优
’
及其种间杂交实生后代的
94
个单株，取自于沈阳农业大学葡萄资源圃。取幼嫩
叶片于
-80
℃
保存备用。
3.2
试验方法
3.2.1
基因组
DNA
的提取和检测
DNA
的提取采用
Hanania(2004)
的改良
CTAB
法。经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测浓度
及质量后将样品浓度稀释至
10 ng•μL
-1
，并于-
20
℃
保存。
3.2.2 SRAP-PCR
扩增程序及扩增产物的检测
SRAP-PCR
扩增反应选用体系参照郭大龙等
(2010)
的研究方法并加以适当修改，
20 μL
体系包括
模板
DNA 10 ng
，
Primer
浓度为
0.8 μmol• L
-1
，
dNTPs
浓度为
0.2 mmol• L
-1
，
Mg
2+
浓度为
3.2mmol• L
-1
，
Taq
DNA
聚合酶为
2.0 U
。
SRAP-PCR
扩增程序为：
94
℃
预变性
5 min
；
94
℃
变性
1 min
，
35
℃
退火
1 min
，
72
℃
延伸
1 min
，
5
个循环；
94
℃
变性
1 min
，
50
℃
退火
1 min
，
72
℃
延伸
1 min
，
35
个循环；
72
℃
最后延伸
10 min
，
4
℃
保存。
扩增结束后，扩增产物于
10%
的聚丙烯酰胺凝
胶电泳进行分离，电泳结束后进行银染检测。