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郭修武等
, 2011,
应用
SRAP
分子标记技术鉴定葡萄种间杂交后代
,
分子植物育种
Vol.9 No.52 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0052)
1390
等
(1997)
用
RAPD
标记鉴定了圆叶葡萄和真葡萄亚
属间的远缘杂种。
相 关 序 列 多 态 性 分 析
(sequence-related
amplified polymorphism, SRAP)
是一种基于
PCR
的
分子标记技术，由
Li
和
Quiros(2001)
提出，其基本
原理是通过设计一对引物对
ORFs (openreading
frames,
开放阅读框
)
进行扩增，因个体不同以及物
种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态
性。
SRAP
技术具有简便、快速、稳定、多态性高，
在基因组中分布均匀，不需预知物种的序列信息的
特点。本研究采用
SRAP
技术对葡萄种间杂交组合
‘
红地球
×
双优
’
实生后代进行杂种的真实性检测，为
今后杂种群体的进一步利用奠定基础。
1
结果与分析
1.1
基因组
DNA
的检测
对双亲及
94
份杂交后代共
96
份材料的
DNA
浓
度和质量进行检测，经紫外分光光度计测定，所提
取
DNA
的
OD
260
/
OD
280
比值均介于
1.7
和
1.9
之间。
琼脂糖检测结果表明，提取的
DNA
为一条清晰完整
的带，与
λDNA
的位置基本相同，条带没有明显的
拖尾，无蛋白质和
RNA
污染。说明本试验提取的
DNA
完整，纯度高，符合本试验的要求
(
图
1)
。
图
1
葡萄部分杂交后代基因组
DNA
电泳
注
:
图中
1~3
号样品为
λDNA,
从左到右分别为
100 ng, 150
ng, 200 ng; 4~17
为杂交后代
Figure 1 Electrophoresis of genomic DNA for some progenies
Note: Number 1~3samp1es in the upper figure are λDNA, from
left to right are 100 ng, 150 ng, 200 ng; Number 4~17 were
cross progenies
1.2 SRAP
引物组合的筛选
将
80
对引物组合在双亲中进行
SRAP-PCR
扩
增，有
20
对引物组合扩增条带丰富、清晰并出现了
父本特异性条带
(
图
2)
，这些引物都可以用于杂交后
代的真实性鉴定。我们从中选取
5
对扩增条带较清
晰容易分辨的引物，即引物组合
Me1Em10
-
212,
Me2Em4
-
87, Me2Em5
-
103, Me4Em6
-
175, Me8Em5-
-
205
用于
‘
红地球
×
双优
’
杂交后代的鉴定。
图
2
部分引物组合筛选的扩增结果
注
: M: DNA marker;
每对引物组合的试验材料左边为母本
红地球
,
右为父本双优
Figure 2 Amplified results with some primer combinations
Note: M: DNA maker; The experimental materials were Red
Globe grape and Shuangyou from left to right in each primer
combinations
1.3
红地球
×
双优后代杂种鉴定
本研究中应用的
SRAP
标记多为显性标记，符
合孟德尔遗传规律。根据孟德尔的分离定律与自由
组合定律，理论上如果使用杂合的显性标记鉴定有
性杂交后代的真实性，应至少使用
5
个父本标记
(
如
果引物可以获得多个父本标记，引物数量就少于
5
个
)
，因为每个杂合显性标记只能鉴定出有性杂交后
代的
50%
为真杂种，鉴定概率为标记
(50%)
Ⅰ
十标
记
(25%)+
Ⅱ
标记
(12.5%)+
Ⅲ
标记
(6.25%)+
Ⅳ
标记
3.13%=96.9%
Ⅴ
，
5
个标记便可将
F
1
代群体中
96.9%
的杂种鉴定出来
(
张开春和李荣琪
, 1997)
。本试验采
用
5
对引物对两个亲本的杂交后代进行逐步鉴定，
首先用
Me8
-
Em5
引物对所有杂交后代进行鉴定，
共有
41
个后代具有父本特异带，初步确认为真杂
种；然后用
Me1
-
Em10
引物对其余的
53
个后代再
次鉴定，其中有
33
个单株中具有父本特异带；剩
余的
20
株个体再用
Me4
-
Em6
引物进行鉴定，有
7
个具有父本特异带；用
Me2
-
Em5
引物对剩余的
13
个个体进行鉴定，有
5
个具有父本特异带。最后对
以上无父本特异带的
8
个后代用
Me2
-
Em4
引物进
行鉴定，
8
个后代有
1
个能扩增出父本特征带。对
于以上引物鉴定过的
7
个未出现父本特异带的后
代，用
Me6Em7
和
Me6Em3
引物进行鉴定，结果
均未出现父本特征带。综合所有引物的鉴定结果，
94
个单株中确认
87
个株为双亲真杂种。
为验证结果的准确性，利用以上使用的
5
对引
物分别对所有杂交后代进行重复鉴定，鉴定结果与
之前结果完全一致。图
3
为
Me8
-
Em5
引物组合在