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王海莲等
, 2011,
高粱
SSR
技术体系的优化及分子连锁图谱的构建
,
分子植物育种
Vol.9 No.47 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0047)
1352
RIL
群体，标记数从
21
到
276
不等，连锁群个数最少
的
5
个，最多的
17
个。自
1997
年以来，
SSR
标记以其
数量丰富，信息量高，呈共显性，重复性好，易
于操作，结果可靠等优点而逐渐被应用于高粱分子
标记连锁图谱的构建
(Taramino et al., 1997; Kong et
al., 2000; Bhattramakki et al., 2000; Menz et al., 2002;
Wu et al., 2006; Ritter et al., 2008; Shiringan et al.,
2010)
。随着高粱
(
自交系
BTx623)
全基因组测序的完
成
(Paterson et al., 2009)
，使人们不仅对高粱基因组
有了全面的了解，也为基因组
SSR
标记的开发和分
子标记连锁图谱的构建奠定了基础。
在高粱分子连锁图谱的构建中需要对大量样
品进行基因型分析。为了提高实验的效率，需要摸
索一种经济快速有效分析后代群体的
SSR
技术体
系。前人对其它作物
SSR
反应体系的优化大多是从
模板
DNA
的浓度，引物浓度，
dNTP
浓度，
MgCL
2
浓度以及
Taq
酶的用量优化组合，筛选出最佳的
PCR
反应体系。在确立了最佳的
PCR
反应体系后，
怎么在最短的时间内利用最经济的方法得到可靠
的实验结果，也是
SSR
聚丙烯酰胺凝胶中需要解决
的问题。在高粱中，也有对凝胶的浓度
(
李玥莹等
,
2007)
和银染方法
(
韩永亮等
, 2006;
牛楠等
, 2010)
等进行的研究，但是上述研究均是针对变性聚丙烯
酰胺凝胶，目前还未见对非变性聚丙烯酰胺凝胶进
行的研究。
为此，本实验从
SSR
反应体系的大小，聚丙烯
酰胺凝胶的浓度以及银染染色的步骤进行了研究，
旨在通过筛选整个
SSR
体系中各因素的最佳组合，
建立一套适合本实验室经济快速的高粱
SSR
技术体
系，并以此为基础构建粒用高粱和甜高粱杂交的
F
2
群体分子遗传图谱，为能源甜高粱重要农艺性状的
QTL
定位和分子改良奠定一定的理论基础。
1
结果与分析
1.1 PCR
体系大小对扩增结果的影响
根据
Taq
DNA
聚合酶的使用说明，对反应体系
进行相应比例的缩小，本实验采用了四种反应体
系：
10 µL
，
15 µL
，
20 µL
和
25 µL
，所加各成分的
量如表
1
所示。为了排除
PCR
仪对扩增结果的影响，
本实验对每种体系均随机选取了相同的
12
个样品，
在同一个
PCR
仪中利用引物
Xcup26
同时对四种反
应体系的样品进行扩增。分别用
6%
，
8%
和
10%
的
凝胶进行电泳，利用两种染色方法进行染色，对
4 µL
扩增产物进行分析。由图
1
可以看出，除了利用
10%
的凝胶和第
2
种染色方法条带浓度太大，而不能区
分目的条带外，四种反应体系均能扩增出清晰的目
的条带。
15 µL
体系扩增的目的条带浓度最大，
25 µL
和
20 µL
体系扩增产物浓度差异不大，
10 µL
体系扩
增浓度较低，但是扩增条带比较清晰，完全满足实
验要求。
表
1 10 µL, 15 µL, 20 µL
和
25 µL PCR
体系
Table 1 PCR reaction system of 10 µL, 15 µL, 20 µL and 25 µL
项目
Item
10 µL
15 µL
20 µL
25 µL
模板
DNA 20 ng/µL (µL)
Template DNA 20 ng/µL (µL)
1.00
1.50
2.00
2.50
正向引物
5 µmol/L (µL)
Forward primer 5 µmol/L (µL)
0.40
0.60
0.80
1.00
反向引物
5 µmol/L (µL)
Reverse primer 5 µmol/L (µL)
0.40
0.60
0.80
1.00
10×
Taq
Buffer (µL)
1.00
1.50
2.00
2.50
dNTP Mixtre 2.5 mmol/L (µL)
0.80
1.20
1.60
2.00
Taq
2.5 U/µL (µL)
0.10
0.15
0.20
0.25
ddH
2
O (µL)
6.30
9.45
12.60
15.75