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黄文静等
, 2011, SRAP
和
RGA
标记技术在甘薯的抗茎线虫病遗传多样性中的应用
,
分子植物育种
Vol.9 No.46 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0046)
1344
研究背景
甘薯
(
Ipomoea batatas
(L.) Lam.)
属于旋花科
(Convolvulaceae)
双子叶植物
(Austin, 1988)
，广泛种
植于世界上
100
多个国家。中国是世界上最大的甘
薯生产国家，每年种植面积和生产量分别占世界的
69.4%
和
84.6%(
刘庆昌
, 2004)
。近年来甘薯病害频
发，其中以甘薯茎线虫病最为严重，成为制约甘薯
生产的瓶颈问题。抗病品种的选育和推广是控制该
甘薯茎线虫病的主要手段。抗病育种主要有常规育
种和分子育种。分子育种主要包括抗病基因
(
候选基
因
)
克隆、分子标记筛选等。
目前，应用于甘薯的以
PCR
为核心的分子标
记技术主要包括
RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA)
、
AFLP(Amplified Fragment Length
Polymorphism)(Kriegner et al., 2003;
张大普等
, 2004)
、
SSR(Simple Sequence Repeat)
、
SRAP (Sequence
Related Amplified Polymorphism) (
郝玉民等
, 2007)
、
RGA(Resistance Gene analogue)(
林巧玲
, 2005)
等。由
于
RAPD
技术重复性差、
AFLP
技术复杂、成本昂贵等
的缺点，限制了其在甘薯育种上的广泛应用。
SRAP
即序列相关扩增多态性技术
(Sequence
Related Amplified Polymorphism)
，是由美国加州大
学
Li
和
Quiros
博士
(Li and Quiros, 2001)
于
2001
年提
出来的一种新型的基于
PCR
的
DNA
分子标记系统。
它利用一个
17 bp
的正向引物和
18bp
的反向引物对
生物全基因组进行扩增，通过分析不同材料的
SRAP
扩增图谱便可观察分析材料间的遗传差异。
SRAP
以其高度多态性
(
张四普等
, 2008)
、操作简便
迅速、成本低、可靠性好、重复性高、易于测序等
特点广泛应用于植物遗传多样性分析
(Ferriol et al.,
2003)
、遗传图谱构建
(Pan et al., 2010)
、基因定位克
隆、比较基因组学
(Li et al., 2003)
等方面。
RGA
即抗病基因同源序列
(Resistance Gene
analogue)
，是克隆植物抗病基因的一条新途径。其原
理是根据己克隆植物抗病基因的保守结构域设计简
并引物
,
扩增获得
RGAs,
然后分析
RGAs
与抗病基因
的关系
,
确定候选抗病基因从而获得新的抗病基因
(
徐兵强等
, 2004)
。自
1996
年
Kanazin
和
Yu
首次报道用
抗病基因产物的保守序列为引物扩增
RGA
以来，
RGA
不仅应用于克隆和定位
R
基因，还用于分子标记辅助
育种及种质资源多样性研究等
(
肖天霞
, 2006)
。
目前，郝玉民等
(
郝玉民等
, 2007)
已利用
SRAP
技术对
36
个甘薯品种进行了遗传多样性分析，吴洁
等
(
吴洁等
, 2007)
也利用
SRAP
标记技术分析了来自
四川省的甘薯种质资源的亲缘关系，但将
SRAP
和
RGA
技术结合起来研究甘薯的抗病遗传多样性却
鲜有报道。本研究选用
SRAP
标记技术结合
RGA
技
术对甘薯抗茎线虫病进行分子聚类，为抗茎线虫病
育种和优良种质资源的筛选提供一定的理论依据。
1
结果与分析
1.1 SRAP-RGA
扩增产物的多态性分析
本实验选用筛选出的
5
对带型清晰、多态性较
好的引物组合，利用高感品种徐
18
和高抗品种徐
781
为亲本对照，对
50
份供试甘薯材料进行扩增，
所扩增条带的大小一般在
250 bp~2 000 bp
之间，每
对引物组合产生
9~13
条谱带，共产生谱带
57
条，其
中多态性条带为
49
条，占总带数的
85.96% (
表
1)
。
不同的引物对产生的多态率明显不同
(Kriegner et
al., 2003)
。最高是
EM4-S2-A07-F
引物对的多态率为
100%
，最低是
EM8-S1-F03-F
引物对的多态率为
63.6%
。部分扩增结果如图
1
所示。
表
1
各引物对的总带数和多态性条带数
Table 1 The total and polymorphic fragments in all cultivars
引物组合
Primer combination
多态性条带数
No. of polymorphic bands
总条带数
No. of total bands
多态率
(%)
Percentage of polymorphism(%)
EM3-S2-A05-F
10
12
83.3
EM4-S2-A07-F
9
9
100
EM3-S2-A08-F
12
13
92.3
EM8-S1-F03-F
7
11
63.6
EM3-S2-D12-F
11
12
91.7