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张作青等
, 2011,
转
il-4
基因大白菜
(
Brassica Pekinensis
Rupr.)
分子检测及遗传和表达研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.42 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0042)
1322
因是否表达，通常会用到的方法有定量的
ELISA
检
测及定性的
Western
杂交等
(
及晓宇等
, 2009)
。本试验
中对五株
PCR-Southern
杂交呈阳性的样品进行
Western
杂交，结果三株出现杂交条带，基本证明了
il-4
基因已经成功转入大白菜并表达。其余未出现杂
交带的可能是表达量过低所致。
IL-4
在总可溶性蛋
白中的表达量相对较低可能有如下几方面原因：首
先，细胞中存在大量的蛋白酶，可能会降解外源基
因的表达产物，从而使目的蛋白不能在植物细胞中
有效累积。其次，本试验中的转基因大白菜是由花
粉管通道法介导的遗传转化得到的，
il-4
基因可能整
合到异染色质上，而这些异染色质的转录活性低，
甲基化程度高，导致
il-4
不能正常表达。最后，植物
对密码子有一定的偏爱性，本试验中植物表达载体
采用
35S
启动子，并添加
2
倍增强子序列，但
il-4
可
能不符合大白菜对密码子的偏爱性，从而影响
IL-4
表达量和
mRNA
的稳定性
(Wally et al., 2008)
。
2.3
关于不同转化处理对
IL-4
阳性率的影响的讨论
不同转化时机对
il-4
转化率有影响，统计分析
显示哈白二号在花期进行人工授粉后
24
小时左右
进行转化操作
(AH)
的
il-4
阳性率显著高于
12
小时
左右进行的转化操作
(BH)
，根据花粉管通道法的转
化机理，在花期授粉后
12-24
小时进行转化操作时
的转化率差异不大
(
彭杰
, 2004)
。本试验中，哈白二
号
BH
处理组合阳性率偏低，可能是由于
PPT
抗性
筛选或
PCR
检测中出现假阴性，导致阳性个体太
少，转化率偏低。
2.4
关于不同品种对
il-4
转化率影响的讨论
统计分析发现，在转化处理组合相同且为
AH
时，哈白二号的
il-4
阳性率比潍白六号高，但两个品
种差异不显著。原因可能是
il-4
整合到大白菜基因组
中没有品种特异性，在后代的遗传中可能以相似的
规律分离
(
王雷等
, 2006)
。
2.5
关于大白菜自交不亲和性的讨论
自交不亲和现象在被子植物中广泛存在，特别
是十字花科最为普遍，大白菜为十字花科异花授粉
植物，其原种经多代自交以后，一般会引起生活力
衰退，表现出生长势差、抗病力减弱、结实率降低
等，这样必然会影响到育种等相关研究。本试验也
基本证实了这一现象：大白菜自交高世代
T
6
代阳性
率低，田间调查显示，与非转基因植株相比，转
il-4
基因大白菜生长势减弱、植株矮小、抗病性下降。
吕俊等利用蛋白激酶抑制剂
(
槲皮素
)
和蛋白激酶激
活剂
(
佛波酯
)
分别对甘蓝自交不亲和系与自交亲和
系花蕾进行田间处理，结果自交不亲和系的自交亲
和指数与对照相比有所提高，甚至转变为自交亲和
系
(
吕俊等
, 2001)
。除了利用激素等化学方法抑制植
物的自交不亲和性外，一些生物学方法如延迟授
粉、染色体加倍等也可以克服自交不亲和性
(
赵军良
,
2006)
。
近年来，随着转基因技术日渐成熟，利用基因
工程技术培育抗虫抗病新品种是将来农业发展的
一个重要方向，建立高效稳定的遗传转化体系对大
白菜的品种改良和增强抗虫抗病能力显得尤为重
要。另外，利用大白菜的杂种优势，对已经检测的
转基因阳性植株不同品种、株系间进行杂交，避免
自交衰退，试图选育出高表达植株，用于药用蛋白
的生产，这也将是我们今后对转基因大白菜研究的
一个趋势。
3
实验材料与方法
3.1
供试材料
供试材料为大白菜三个品种：哈白二号
(
代号
H2)
、潍白六号
(
代号
W6)
、新世纪
(
代号
XSJ)
，其
原种由哈尔滨市农业科学院提供。进行分子检测的
材料为经
PPT
筛选的大白菜
T
6
代自交株系植株幼
苗；携带
il-4
基因的大白菜通过花粉管通道法介导
转化而来，转化质粒为
P4IL4
，该质粒的部分图谱
见图
6
。
图
6 P4IL4
质粒部分图谱
Figure 6 part of P4IL4 plasmid map
3.2
方法
3.2.1
转
il-4
基因大白菜的春化与授粉
将大白菜种子充分湿润后在
25
℃
恒温培养箱
中浸种
12 h
左右，待大部分种子露白时，将种子用
厚毛巾包好放入
4
℃
冰箱中春化处理
30 d
。春化处