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张作青等
, 2011,
转
il-4
基因大白菜
(
Brassica Pekinensis
Rupr.)
分子检测及遗传和表达研究
,
分子植物育种
Vol.9 No.42 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0042)
1323
理时要注意始终保持种子湿润，但也要注意温度不
能过低，以免冻坏种子，待大白菜生长至抽薹开花
期，进行人工自交授粉。
3.2.2
转
il-4
基因大白菜的
PPT
抗性筛选
待大白菜长出两片真叶时，用
300 mg/L~350
mg/L
的
PPT(
爱诺园草净
)
喷洒叶面，并且加入
0.1%
吐温
-20
以增加试剂在叶片的附着力。强日照条件
下反应
10 d
，淘汰枯黄死亡的植株。
3.2.3
转
il-4
基因大白菜基因组
DNA
的制备
以
CTAB
法
(
凌春莹等
, 2005)
提取筛选得到的
大白菜
T
6
代
PPT
抗性植株的基因组
DNA
。
3.2.4
转
il-4
基因大白菜的
PCR
检测
为了检测模板
DNA
质量，排除由模板中杂质
影响而造成的假阴性结果，以待测大白菜总
DNA
为模板，进行内对照
PCR
。阳性对照、阴性对照、
空白对照分别为
P4IL4
质粒、非转基因大白菜和水。
之后对
T
6
代大白菜进行
il-4
基因的
PCR
检测。内
对照引物和
il-4
基因引物的扩增产物长度分别为
433 bp
和
243 bp
。内对照与
il-4 PCR
的反应体系见
表
4
，反应条件见图
7
。
表
4
内对照、
il-4 PCR
反应体系
Table 4 PCR reaction system of
rbcl
and
il-4
gene
药品
(
试剂
)
Reagent
体积
Volume
10×PCR
缓冲液
(TAKARA
产品
)
10×PCR Buffer (TAKARA products)
1.0
μ
L
dNTP
混合物
(
各浓度为
2.0 mmol/L, TAKARA
产品
)
dNTP mixture (Each concentration was 2.0 mmol/L, TAKARA products)
1.0
μ
L
F (
上游
)
引物
(
浓度为
20
μ
mol/L)
F (Upstream) primer (Concentration 20
μ
mol/L)
0.1
μ
L
R (
下游
)
引物
(
浓度为
20
μ
mol/L)
R (Downstream) primer (Concentration 20
μ
mol/L)
0.1
μ
L
Taq
DNA
聚合酶
(5 U/
μ
L)
Taq
DNA polymerase (5 U/
μ
L)
0.08
μ
L
模板
DNA
Template DNA
1.0
μ
L
无菌去离子水
Sterile deionized water
补至终体积
10.0
μ
L
Supplement to a final volume of 10.0
μ
L
图
7
内对照、
il-4PCR
反应条件
Figure 7 PCR reaction conditions of
rbcl
and
il-4
gene
用
1~1.2%
的琼脂糖凝胶电泳检测结果。将三次
均扩增出
il-4
基因特异性条带的植株视为阳性株。
3.2.5
转
il-4
基因大白菜的
PCR-Southern
杂交
以
PCR
扩增得到的
T
6
代大白菜
il-4
阳性植株
的基因组
DNA
为待测样品，进行
PCR-Southern
杂
交，对照组的设置与
PCR
检测相同。操作步骤参照
《
DIG High Prime DNA Labeling and Detection
Starter Kit
Ⅰ
》
(Roche
公司
)
。
3.2.6
转
il-4
基因大白菜的
Western
杂交
为了进一步确定
il-4
基因在转基因植株中是否
表达，对经
PCR
、
PCR-Southern
检测的部分
il-4
阳性
植株进行
Western
杂交。按直接提取法提取转基因大
白菜蛋白粗提液，参照《分子克隆实验指南》对转
il-4
基因大白菜进行
Western
杂交
(J.
萨姆布鲁克
,
1992)
。
3.2.7
转
il-4
基因大白菜的生长势与抗病性调查
将转
il-4
基因大白菜植株和非转基因植株均定