Basic HTML Version
曾建斌等
, 2011,
烟草优质品种花全长
cDNA
文库的构建和质量鉴定
,
分子植物育种
Vol.9 No.40 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0040)
1306
出大量该基因家族成员
(Kramer et al., 2004; Guo et
al., 2007;
韩利涛等
, 2010)
。利用转录因子的调节功
能，还能对开花期和花型进行调节，这在生产中具
有重要意义。如拟南芥中的
AP1
基因转化番茄花期
提前，出现自然整枝的现象，果实心室数目增多
(
王
翊等
, 2010)
。通过转录因子调节花粉育性，可以产
生不育的花粉，创造不育系，简化育种程序，对杂
交育种等生产实践有重要意义。除此之外，现在已
经证明
miRNA
在植物开花时间调控及花器官发育
过程中也起着不可替代的作用
(
侍婷等
, 2010)
。
作为模式植物的拟南芥、矮牵牛、金鱼草、水
稻和杨树花发育都有较多研究，而烟草
(
Nicotiana
tabacum
)
作为另一种重要的模式生物，但对其花发
育的研究甚少。烟草是四倍体，基因组大而复杂，
从功能基因组学出发发掘研究烟草花发育功能基
因，有利于高效揭示花发育机理；另外，研究烟草
花发育分子机理有助于补充对花发育的分子机理
的认识，也必将对烟草遗传改良和杂种优势利用有
意义。本文利用
SMART (switching mechanism at
5'end of RNA transcript)
技术
(Lin et al., 2004;
王家
保等
, 2009 ; Li et al., 2010)
，成功构建了福建优质烤
烟品种花不同发育时期的
cDNA
文库，为高效克隆
和研究花发育功能基因奠定了基础。
1
结果与分析
1.1
总
RNA
的提取鉴定
高质量的
RNA
是构建高质量文库的前提。本
研究提取的总
RNA (
见图
1)
，用微量紫外分光光度
计测
A260/A280=1.82
表明所提
RNA
较纯。从图中
可以看出总
RNA
的
28S rRNA
和
18S rRNA
两条带
清晰，且
28S
条带亮度约为
18S
的两倍，隐约可见
5S rRNA
，没有基因组
DNA
污染。以上结果表明，
所提
RNA
没有降解，完整性较好，可以进行文库
构建的后续工作。
1.2
双链
cDNA
合成结果
总
RNA
逆转录得第一链
cDNA
，然后以抑制
PCR
方法合成双链
cDNA (
见图
2)
，从图中可以看出
双链呈弥散状分布，最高片段超过
2 000 bp
，信息
较为完整，表明双链
cDNA
可用于连接和转化。
图
1
总
RNA
凝胶电泳
Figure 1 Gel electrophoresis of total RNA
图
2
双链
cDNA
凝胶电泳
注
: M: DL2000
分子量标准
; 1:
双链
cDNA
Figure 2 Gel electrophoresis of double strand cDNA
Note: M: DL2000 marker; 1: Double strand cDNA
1.3
文库质量鉴定
1.3.1
文库库容量及滴度测定
原始文库菌液稀释涂板后，计算克隆数，按照
cDNA
文库容量计算公式：库容量
=
每
μL
文库菌液所
含的菌落数×文库菌液总体积，得到初级文库库容
为
4.05
×
10
6
；扩增文库滴度参照文库构建试剂盒
Creator
TM
SMART
TM
cDNA Library Construction Kit
说明书上的计算公式：文库滴度
cfu/mL=
菌落数×稀
释倍数×
10
3
，得到扩增文库滴度为
6.75
×
10
9
pfu/mL
，
可用于长期保存。
1.3.2
文库重组率及插入片段鉴定
随机从板上挑取
20
个克隆，用载体通用引物
M13F
和
M13R
引物
PCR
扩增，
1%
的琼脂糖凝胶电泳
检测
(
见图
3)
。如图
3
所示，在
20
个菌液
PCR
结果中，
除泳道
16
外，剩余
19
个都有条带，重组率为
95%
。
片段大小大都集中在
1 000 bp~2 500 bp
之间，平均
长度约为
1 400 bp
。