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张如华等
, 2011,
柽柳
EST-SSRs
标记开发与群体检测
,
分子植物育种
Vol.9 No.38 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0038)
1292
见于草地、滩涂、海滨沙地。柽柳适应性广，既抗
旱、抗病虫害，又耐盐碱、耐水湿，且生长快，又
具较高的观赏价值。柽柳枝条可供编织篮、筐、篓
等各种容器和工艺品；树皮、嫩枝叶为中药材，又
是牛、马、羊的理想饲料；幼枝、树
(
根
)
皮可提取
栲胶。由于柽柳的生态价值和经济价值，将在我国
广大地区，尤其是盐碱地的造林绿化发挥十分重要
的作用。有关柽柳的研究，尤其是遗传学方面的研
究较为薄弱，如遗传多样性的研究仅见利用
RAPD
标记对黄河三角洲三个群体进行了初步研究
(
赵景
奎等
, 2008)
。本研究旨在通过搜索柽柳属植物
EST
中的重复序列，开发适用于柽柳遗传研究的通用性
EST-SSRs
标记，并以开发的标记对柽柳不同区域的
5
个群体进行遗传多样性检测，为柽柳乃至柽柳属
其它树种的遗传多样性等方面的研究提供优良的
分子工具。
1
结果与分析
1.1
柽柳属植物
EST-SSRs
分布分析
从
NCBI
数据库共获得
22 715
条柽柳属植物
EST
序列，其中刚毛柽柳
(
T. hispida
Willd.) 17 401
条，紫
杆柽柳
(
T.androssowii
Litv.) 4 756
条，多枝柽柳
(
T.
ramosissima
Ledeb.) 347
条，白花柽柳
(
T. albiflonum
)
208
条。通过序列拼接，共得到独立基因序列
9 439
条，其中单序列
(singletons) 5 712
条，重叠群
(contigs)
3 727
条。本研究利用
SSRIT
在线工具仅对
2
-
6
核苷
酸重复类型的精确型
SSR
——指不间断的，且单一
的重复类型
(Weber, 1990)
。进行检索分析，从中发
掘出分布于
202
条精确型基序中的
206
个
EST-SSR
位
点，
SSR
发生频率
(
含有
SSR
位点的独立基因序列与
总独立基因序列数目之比
)
为
2.14%
，平均分布距离
为
54.99 kb
，其中
198
条
EST
含有
1
个
SSR
，
4
条
EST
含有
2
个
SSR
。
EST
具体分布情况见表
1
。
本研究共得到
76
种
EST-SSR
重复基序，在所检
索的柽柳属植物
EST-SSR
中，二核苷酸和三核苷酸
重复是主要的重复类型，分别占
33.01%
、
40.29%
，
共有
5
种二核苷酸重复基序，其中主要为
4
种，而三
核苷酸重复基序类型很多，达
25
种，但各类型所占
比例较小，最多为
AAT/TTA
，占
7.28% (
表
2)
。四次
以上核苷酸重复占比例逐步减少，依次为
12.62%
、
7.28%
、
6.79%
，除
TTTA
出现两次外，其各基序类
型只出现一次。
表
1
柽柳属主要植物的
EST-SSRs
分布特点
Table 1 Characteristics of EST-SSRs distribution
参数
Parameter
数值
Value
EST
总数
Total number of EST
22712
拼接得到的
Unigene
总数
Total number of splicing
9439
各植物含有
SSR
的
EST
总数
Total number of motif
202
刚毛柽柳基序
Motif of T. hispida
152
紫杆柽柳基序
Motif of
T. androssowii
46
多枝柽柳基序
Motif of
T. ramosissima
4
含
1
个
SSR
位点基序
Including one SSR loci
198
含
2
个
SSR
位点基序
Including tow SSR loci
4
1.2 EST-SSR
标记的多态性
根据引物设计原则，含
SSR
的
202
条
EST
中共设
计了引物
164
对，随机选取
75
对进行了引物合成，
其中
40
对引物在柽柳能扩增出清晰的产物，且片段
的大小与预期一致。提取的绝大多数柽柳
DNA
质量
较高，可满足
PCR
实验需要。经检测，有
14
对引物
在柽柳群体中表现出多态
(
图
1
为第
6
号引物的部分
群体扩增结果
)
。表现多态的
SSR
主要为二核苷酸重
复和三核苷酸重复
(
各有
5
对引物
)
，占总数的
70%
以
上，而四、五及六核苷酸重复明显较少
(
分别占
1
对
,
1
对和
2
对
)
。
14
对引物在
6
个柽柳天然群体中扩增出
了最多
6
个等位条带，最少
3
个等位条带
(
表
3)
。
1.3
以
EST-SSR
标记揭示的柽柳群体变异
以
14
对引物对
5
个柽柳天然群体的遗传多样性
分析表明，
5
个群体实际杂合度从
0.459 8
至
0.565 6
，
期望杂合度从
0.556 3
至
0.581 6
，
Nei
基因多样性指
数的变化范围为
0.549 3~0.569 5
，按照
Nei
的基因多
样度指数对
5
个群体由高到低排序为：浙江慈溪群、
山东河口、山东垦利、浙江余姚、浙江海盐。
5
个
群体间的遗传距离在
0.027 7~0.137 4
之间，遗传相
似系数在
0.871 6~0.972 6 (
表
4)
。根据开发的
SSR
标
记检测结果，利用
UPGMA
聚类法能很好地将不同
空间距离的群体区分开来，可在遗传距离为
0.078