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匡猛等
, 2011,
基于棉花
SSR
的多色荧光标记检测技术
,
分子植物育种
Vol.9 No.31 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0031)
1242
三种情况出现的比例相对较低。如图
2C
所示，当两
个或两个以上等位基因同时扩增时，多个特异峰的
峰高可能会存在差异，即表现为高低峰，这种情况
在常规
PAGE
电泳银染检测时表现为强弱带，可能
是由于不对称扩增造成。
1.3
荧光多重
PCR
组合的建立
通过预实验的反复摸索，本研究对
36
对
SSR
引
物进行了适当的组合，分成了
9
个四重组合，每个
组合中的四个
SSR
引物分别以
FAM
、
HEX
、
TMR
和
ROX
四种不同颜色的荧光染料标记
(
见表
1)
，多重
PCR
组合的建立主要依据如下基本原则：①组合中
各引物的扩增产物片段范围不能交叉；②避开非特
异扩增产物峰的相互影响；③采用多色荧光标记；
④对于扩增效率较低的引物优先使用
FAM
进行标
记
(
因
FAM
染料的荧光信号较其他染料要强
)
；⑤选
择
SSR
左右引物中较好的
5′
端进行染料标记，尽量
避开二聚体结构。如图
3
所示为四色荧光组合六在
一个样品上的毛细管电泳检测效果
(
橙色低峰均为
Liz
-
500
分子量内标
)
。
表
1
供试引物名单及荧光多重组合
Table 1 Fluorescent-labeled primers and sets used
组合编号
Set No.
引物编号
Primer No.
重复序列
Repeat sequences
标记荧光
Fluorescence labeled
组合编号
Set No.
引物编号
Primer No.
重复序列
Repeat sequences
标记荧光
Fluorescence labeled
1
M11
-
1
CA
FAM
6
M23
-
1
GA
FAM
M01
GCA
HEX
M05
-
1
CAG
HEX
M11
AG
TMR
M16
CTT
TMR
M04
GAC
ROX
M02
ACAT
ROX
2
M05
TC
FAM
7
M03
-
1
TTC
FAM
M06
-
1
AAT
HEX
M13
AG
HEX
M06
AT
TMR
M20
TC
TMR
M17
-
1
AATT
ROX
M10
GA
ROX
3
M21
GA
FAM
8
M17
GATAGG
FAM
M15
-
1
AC
HEX
M14
TG
HEX
M19
AGA
TMR
M22
GT
TMR
M13
-
1
GA
ROX
M03
GGC
ROX
4
M18
CA
FAM
9
M26
TG
FAM
M12
GA
HEX
M24
GGCTTC
HEX
M08
AC
TMR
M15
ATAC
TMR
M25
-
1
GTA
ROX
M07
ATA
ROX
5
M23
GA
FAM
M21
-
1
AGC
HEX
M09
AG
TMR
M25
CA
ROX
图
3
四色荧光多重
PCR
组合的毛细管电泳检测效果
Figure 3 Four fluorescent multiplex PCR sets detected in capillary electrophoresis