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匡猛等
, 2011,
基于棉花
SSR
的多色荧光标记检测技术
,
分子植物育种
Vol.9 No.31 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0031)
1243
2
讨论
对常规
PAGE
电泳银染检测结果进行分析时，
各泳道样品扩增产物片段的大小需要与分子量
Marker
对比获得，当样品泳道离
Marker
泳道相距较
远或片段相差较小时，实验数据会产生一定的误
差，尤其在分析的材料和位点较多时，不同胶板间
数据的整合与统是一项很繁琐的工作，数据结果的
准确性也很难保证。而在多色荧光检测系统中，各
毛细管泳道中均含有分子量内标，具有荧光信号的
扩增产物片段大小通过与其所在泳道分子量内标
比对即可准确的获得其分子量大小，最大程度上保
证了数据结果的准确性，且数据的读取均是通过仪
器自动采集，大大减少了读板时人为造成的误差。
为提高
SSR
检测效率，适应高通量
DNA
指纹分
析的需要，
1988
年
Chamberlain
等
(Chamberlain et al.,
1988)
首次提出多重
PCR
这一概念，该方法已成功地
应用到
DNA
检测的各个领域，如缺失、突变、多态
性分析、
RT-PCR
分析等，在植物生物学的各个领域
发挥着重要作用，如在种质纯度鉴定
(James et al.,
2003)
、病虫害检测
(Dovas et al., 2002)
、植物分子育
种
(Ma et al., 2003)
等方面已成为重要而有效的研究
方法。马雪霞等
(
马雪霞等
, 2007)
利用非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳结合银染技术，选取
6
对棉花
SSR
引
物，配成三组两重
PCR
用于构建亚洲棉
(Gossypium
arboreum)
遗传图谱，对棉花
SSR
多重
PCR
技术进行
了初步研究。而基于多色荧光标记构建多重
PCR
组合相比常规
PAGE
电泳银染检测方法要相对容
易，且可以实现通量更高的组合，本研究基于四色
荧光标记，仅通过对
SSR
引物标记不同的荧光染
料，依据多重组合的基本原则，实现了四重
PCR
组合，若进一步研究同色标记引物间的多重组合，
则可在同一泳道中形成更多的组合，进一步提高检
测通量。
总而言之，多色荧光检测系统具有高精度、高
通量、自动化程度高的优点，尤其适用于大规模材
料的分析研究，但购置与运行
DNA
遗传分析仪的所
需费用很高，荧光标记引物的合成成本较普通引物
也高出很多，一般实验室条件无法承受，而常规的
PAGE
电泳检测由于无需昂贵的实验仪器，在分析
少量材料时显得经济适用。在实际检测过程中可将
这两种方法有效的结合起来，利用常规
PAGE
电泳
进行标记筛选或少量材料的分析，对筛选获得的核
心引物采用多色荧光检测系统进行大批量材料的
高通量检测分析。
3
材料与方法
3.1
供试材料
所用材料为
2007
-
2009
年三年的全国棉种质量
抽查项目获得的我国棉花主栽品种
101
份，本单位
自育中棉所系列品种
37
份
(
包括
4
份常规种与
11
份成
套杂交种
)
，合计
138
份
(
材料名单略
)
。
3.2 SSR
引物
36
对
SSR
引物为本课题通过前期大量筛选获
得，分布于棉花全基因组
26
条染色体，每条染色体
1~2
对，荧光引物的序列由北京阅微基因技术有限
公司合成
(
见表
1)
。
3.3
试验方法
DNA
提取：采用匡猛等
(
匡猛等
, 2010)
的单粒棉
花种子
DNA
快速提取方法制备
DNA
样品，每个品种
6
个重复。
20 µL
反应液中包括：
2 µL DNA
模板，
0.15 mol/L
SSR
左右引物，
1
×
Buffer
，
0.2 mmol/L dNTP
，
1 U
Taq
聚合酶。
PCR
扩增程序：
94
℃预变性
4 min
；
94
℃变
性
45s
，
55
℃退火
45s (
个别引物适当调整退火温度
)
，
72
℃延伸
45s
，共
32
个循环；
72
℃延伸
12 min
，一个
循环。
毛细管电泳五色荧光检测：将
PCR
产物进行适
当稀释后，取
1 μL
稀释液加
8.5 μL
去离子甲酰胺、
0.5 μL Liz
-
500
分子量内标，于
ABI 3730xlDNA
分析
仪上进行毛细管电泳检测。预电泳
13 kV
，
3 min
；
1.5 kV
进样
10s
；电泳
10 kV
，
40 min
。用
GeneMapper
软件对检测结果进行分析。
作者贡献
匡猛、杨伟华和许红霞是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；王延琴、周大云及冯新爱完成数据分析，匡猛
完成论文初稿的写作；苏畅和张玉翠参与实验设计，试验结
果分析；杨伟华是项目的构思者及负责人，指导实验设计，
数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的
文本。
致谢
本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项