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栗婷等 , 2011, 落叶松体细胞胚胎全长 cDNA 文库构建及初步分析, 分子植物育种 Vol.9 No.26 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0026)
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Reverse Transcriptase参照SMARTTM cDNA Library
Construction Kit说明，合成cDNA第一链。PCR反应条
件：95℃ 20 sec，31个循环：95℃ 5 sec，68℃ 6 min；
4℃结束反应，反应体系为50 μL 。
引物及寡核苷酸片段序列如下：
SMART IV Oligo nucleotide
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATT
ATGGCCGGG-3'；
CDSIII/3’PCR Primer
5'- ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30
N一1N-3'；
5'PCR Primer
5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT -3'
3.2.5 cDNA分级分离
合成的双链 cDNA 经蛋白酶 K 消化和 SfiI 酶切
后过 CHROMA SPIN- 400 柱子进行分级分离，共收
集 15 管，每管取 3 μL 进行 1%琼脂糖电泳检测，
根据电泳结果，取大于 500 bp 的片段混合并按照
SMART cDNA Library Construction Kit 说明浓缩，
溶于 7 μL 去离子水中。
3.2.6 cDNA与载体的连接及包装
cDNA 与 λTriplEx2 载体的连接设 3 个连接梯
度 (表 3)，反应体系为 5 μL ，16℃下连接过夜。然
后按照 MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts 方法
包装。用 500 μL phage dilution Buffer 稀释后再加入
25 μL 氯仿。轻轻涡旋混匀，于 4℃储藏。
表3 cDNA 与载体连接反应的体系
Table 3 Reaction systems of ligating cDNA to vector
成分
Component
反应 A (μL)
Reaction A (μL)
反应 B (μL)
Reaction B (μL)
反应 C (μL)
Reaction C(μL)
cDNA 0.5 1.0 1.5
Vector (500 ng•μL-1) 1.0 1.0 1.0
10×连接缓冲液
10×Connection Buffer
0.5 0.5 0.5
ATP(10 mmol) 0.5 0.5 0.5
T4 DNA 连接酶
T4 DNA Ligase
0.5 0.5 0.5
去离子水
Deionized water
2.0 1.5 1.0
3.2.7文库质量检测及扩增
将包装得到的 cDNA 文库按 10-2、10-3、10 -4、
10-6 进行稀释，每梯度设置 3 个重复，取 100 μL 的
稀释液和 100 μL OD 值约为 0.8-1.0 的 XL1-Blue
混合，37℃吸附 15 min。再与 2 mL 上层琼脂混匀，
倒在预热的 LB 平板上，37℃培养 6~18 h，待噬菌
体长出后，计数噬菌斑，按照公式：文库滴度= 平
板上克隆数× 稀释倍数 ×1000/ 涂板体积 (μL) 计算
cDNA 文库滴度。根据 cDNA 文库滴度，按照文库
构建试剂盒说明，在顶层琼脂中加入 IPTG 和 X-gal，
通过蓝白斑计数进行重组率的测定。从初始文库中
随机挑取 22 个噬菌斑，加入 5'端 (5'PCRCTCGGGA
AGCGCGCCATTCTCTTGG)和 3'端 (3' PCRATACG
ACTCACTATAGGGCGAATTGGCC)引物'进行 PCR
鉴定，确定文库平均插入片段。
文库的扩增和保存按照 Clontech 试剂盒说明
书的方法进行，取适量扩增后的文库以 10-2、10-4、
10-6、 10-8 的稀释度测定扩增文库滴度，每个稀释
度设置 3 个重复。待噬菌斑长出后计数，计算扩增
文库滴度。
3.2.8文库序列测定及分析
从初始文库中随机挑取 16 个噬菌体克隆，为
操作方便，先将这 16 个克隆分别转化为质粒克隆：
将各阳性克隆接种到 350 μL 的 1×Lambda dilution
Buffer。涡旋混匀，37℃，200~250 rpm 下培养 3- 4 h
后取其 150 μL 和 200 μL 的 Bm25.8 (OD 600 值达
1.1- 1.4)细菌培养物混合，31℃静置 30 min ，再加入