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栗婷等
, 2011,
落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库构建及初步分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.26 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0026)
1193
以保证体细胞胚发育相关
RNA
种类的完整性。
文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴定
cDNA
文库质量的重要指标
(
周祥明等
, 2007)
。当要
求克隆到某低丰度
mRNA
的概率为
99
％时，文库的
克隆数不应低于
1.7×10
5
个。文库的重组百分率应达
到
80%
以上
(http://www.clontech.com/images/PT3000
-1.pdf)
，本文库滴度为
2.25×10
6
pfu/mL
，重组率为
95.13%
，说明构建的落叶松体细胞胚胎
cDNA
文库
满足构建高质量文库的要求，文库的代表性较高一
般认为，非哺乳动物如植物、昆虫、酵母等的
PolyA+RNA
分布在
0.5~3.0 kb
之间
(
周祥明等
, 2007)
。
本实验中双链
cDNA
的凝胶电泳图显示
cDNA
分布
在
0.3
-
4kb
之间，对随机挑取的
22
个克隆进行
PCR
扩
增检测，观察到扩增片段范围为
0.5
-
4kb
之间，这说
明库内的
cDNA
序列具有完整性。
2.2
部分克隆序列分析
在成功构建落叶松体细胞胚胚胎全长
cDNA
文
库的基础上，对少数部分序列进行随机克隆和
ESTs
测序，并对测序结果做了简单分析，但
13
条
Unigenes
中有
6
条序列不能在蛋白质数据库中找出其同源序
列。经分析可能有以下原因：首先蛋白质数据库有
限，一些新基因在数据库中不存在同源蛋白质
(
王博
等
, 2008)
；其次，研究表明，针叶树种胚胎发育的
分子生物调控机理和目前研究较为深入的拟南芥
还是有很大差异
(Cairly and Pullman, 2007)
。由于缺
少参考基因组信息，对针叶树功能和比较基因组学
的研究受到限制，且针叶树胚胎与其它组织在基因
表达上也有显著不同
(Ralph et al., 2008)
，这都可能
导致本研究中较多体细胞胚胎的
cDNA
序列在数据
库无同源序列；再次可能是目前数据信息挖掘不
够，
BLASTX
的依据是氨基酸序列相似性，而氨基
酸序列差异较大的蛋白可能会具有相同功能
(
王博
等
, 2008)
。随着蛋白质数据库在不断增大、更新，
将来一些未知功能基因会得到注释。
落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库的构建，为
探索落叶松体细胞胚胎发育过程奠定基础，也可
为研究其它树种体细胞胚胎发育、合子胚发育提
供科学依据，本实验室欲从库中克隆与调控落叶
松体细胞胚胎发育相关基因、
microRNA
靶基因
等，进一步揭示落叶松体细胞胚胎发育过程及其
调控机理。
3
材料与方法
3.1
实验材料
松杉类等针叶树体细胞胚胎发育过程分为三
个阶段：原胚团时期
(proembryogenic mass)
、胚胎
形成早期
(early embryogeny)
和胚胎形成晚期
(late
embryogeny) (Filonova et al., 2000)
。为了最大程度
获得落叶松体细胞胚胎发育相关基因，以落叶松胚
性细胞系
638
#
继代培养
48 h
、
15 d
以及体细胞胚成
熟阶段
48 h
的胚性组织为供试材料
(
吕守芳等
,
2005)
。各材料取材后于液氮中保存备用。
3.2
研究方法
3.2.1
试剂
Total RNA Purification Kit
购自
Norgen
公司，
Oligotex
TM
mRNA Purification Kit
购自
Qiagen
公司，
SMART cDNA Library Construction Kit
和
Advantage
2 PCR Kit
购自
Clonetech
公司，
MaxPlax
TM
Lambda
Packaging Extracts
噬菌体包装蛋白购自
Epicenter
公
司。
DL10 000 DNAMarker
购自
TaKaRa
公司。
Surface
Rnase Erasol (
固相
RNase
清除剂
)
购自北京天恩泽基
因科技有限公司。
3.2.2
总
RNA
的提取及质量鉴定
取
50 mg
各材料在液氮中快速研磨成粉末状，
然后依照
Total RNA Purification kit
试剂盒提取总
RNA
，用
ND-1000
测定总
RNA
的浓度和纯度，
1%
琼脂糖电泳检测
RNA
完整度；取
2 μL
各时期材料
总
RNA
，
37
℃温浴
2 h
以上，
1%
琼脂糖电泳检测，
与原总
RNA
比较，判断有无
RNase
污染。
3.2.3 mRNA
的分离
将上述
3
个时期材料总
RNA
等量混合，采用
Oligotex
TM
mRNA Purification Kit
，从总
RNA
中分
离
mRNA
，
ND-1000
测定浓度及纯度，
1%
琼脂糖
电泳检查
mRNA
质量。
3.2.4
双链
cDNA
的合成
取
3 μL
纯化的
mRNA (
约
36 ng)
，加入
1 μL
SMART IV Oligo nucleotide (10 μmol/L)
、
1 μL
CDSIII/3
，
PCR Primer (10 μmol/L)
短暂离心混匀，
72
℃
2 min
后置于冰上放置
2 min
，再依次加入
2 μL
的
5×
第一链反应缓冲液、
1 μL DTT (20 mmol)
、
1 μL
dNTP Mix (10 mmol)
、
1 μL SMARTScribe
TM
MMLV