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栗婷等
, 2011,
落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库构建及初步分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.26 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0026)
1192
图
6
文库插入片段的随机
PCR
检测
注
: M: 1 kb DNA marker; CK:
阴性对照
(
无
DNA
模板
); 1
-
22:
菌落
PCR
片段
Figure 6 PCR insert screening of the primary library
Note: M: 1 kb DNA marker; CK: negative control (no DNA
template); 1
-
22: colony PCR products
中一条未有特异条带，一条片段约在
200 bp
左右，
根据载体信息判断其可能为空载体，其它片段均
在
500 bp
以上，分布在
0.5~4 kb
之间，平均长度约
0.85 kb
。
1.5 ESTs
的分析
随机选取初始文库中
16
个克隆转化为质粒后
测序，获得有效序列
15
个，测序成功率为
94.0%
。
经序列拼接后得到
13
条
Unigenes
，其中
2
个
Contigs
。
其中碱基最长的
Unigene
达
1 077 bp
。拼接后获得的
Unigenes
与
GenBank
中的蛋白质数据库比对，发现
其中具有已知功能
Unigenes 3
个，具有推测功能
Unigenes 2
个，未命名或未知的功能
Unigenes 2
个，
在蛋白质数据库中无同源序列的功能未知
Unigenes
6
个
(
表
2)
2
讨论
2.1
全长
cDNA
文库构建
总
RNA
质量直接影响到文库质量，而影响
RNA
质量的因素主要有三个：一是否有降解；二是否有
污染
(DNA
、蛋白质、小分子物质
)
；三是否完整
(
龙
表
2 cDNA
克隆有效序列比对结果
Table 2 Result of comparison of effective sequences of cDNA clones
克隆号
Clone
登录号
Locus
评分
Score
E
值
E-value
功能预测
Function predictions
Contig1
gb|BT102973.1|
252
2e
-
63
Picea glauca clone GQ0204_E15 mRNA sequence(blastn
结果
)
Contig2
ref|XP_002489002.1|
78.6
3e
-
07
hypothetical protein SORBIDRAFT_0531s002010 [Sorghum
bicolor]
S1
gb|ACY06319.1|
95.5
2e
-
18
class II chitinase 2-3 [Pseudotsuga menziesii]
S2
No hit found
S3
gb|ACF06522.1|
135
4e
-
30
60S ribosomal protein L44 [Elaeis guineensis]
S4
gb|FJ071360.1|
219
2e
-
53
Pinus taeda isolate 1658 anonymous locus 0_3696_01 genomic
sequence
S5
ref|NP_001168316.1|
111
1e
-
22
hypothetical protein LOC100382082 [Zea mays]
S6
gb|ADE77919.1|
127
1e
-
27
unknown [Picea sitchensis]
S7
gb|ADM78576.1|
56.6
1e
-
06
glycosyl hydrolase-like protein [Picea sitchensis]
S8
gb|BT122572.1|
279
3e
-
72
Picea sitchensis clone WS0452_O03 unknown mRNA(blastn
结果
)
S9
No hit found
S10
gb|ADE76290.1|
153
1e
-
35
unknown [Picea sitchensis]
S11
No hit found
松华等
, 2008)
。
RNA
酶的大量存在是导致
RNA
降解
的主要原因，本研究中提取
RNA
时采取以下措施大
大地降低了
RNA
降解的几率：采用固相
Rnase
清除
剂
(Surface RNase Erasol)
擦拭试验台面、移液器、
镊子等无法通过高温或者灭菌处理的器材；试验过
程中及时更换手套；在超净工作台中提取
RNA
。
落叶松胚性组织中多糖、多酚含量较高，为了减少
糖和酚类物质的污染，挑取材料时尽量选择新长出
的、健康的表层的胚性组织。并且严格按照
Total
RNA Purification Kit
和
Oligotex
TM
mRNA Purification
Kit
说明书提取总
RNA
和分离
mRNA
，保证得到高
质量、高纯度的总
RNA
和
mRNA
。构建
cDNA
文库
时，以体细胞胚发育三个时期的胚性组织为材料，
分别进行取样，再把所提取的总
RNA
等量混合，