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栗婷等
, 2011,
落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库构建及初步分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.26 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0026)
1191
图
2
温浴处理后
RNA
电泳图
注
: M: 1kb DNA marker; 1
、
2
、
3:
原各时期材料总
RNA; a
、
b
、
c:
温浴处理后各时期总
RNA
图
Figure 2 Electrophoresis of total RNA after incubation
Note: M: 1kb DNA marker; 1
、
2
、
3: the primary total RNA
from the three development stage of Embryonic tissue; a
、
b
、
c: the total RNA after incubation from three development stage
of Embryonic tissue
图
3 mRNA
反转录成双链
cDNA
电泳图
注
: M1: 1 kb DNA marker; S:
样品双链
cDNA; M2: 100 bp
DNA marker
Figure 3 Electrophoresis of dscDNA
Note: M1: 1 kb DNA marker; S: dscDNA; M2: 100 bp DNA
marker
表
1
总
RNA NanoDrop
-
1000
检测结果
Table 1 NanoDrop
-
1000 analysis of total RNA
材料
Material
继代培养
48 h
胚性组织
Embryonic tissue of 48 h on
maintenance medium
继代培养
15 d
胚性组织
Embryonic tissue of 48 h on
maintenance medium
成熟培养
48 h
胚性组织
Embryonic tissue of 48 h on
maturation medium
A260/A280 2.15
2.14
2.17
A260/A230 2.00
1.82
1.89
正常且量足，满足建库要求。
1.3
分级分离后双链
cDNA
分级分离后双链
cDNA
各管产物于
1.1%
的琼
脂糖凝胶电泳检测
(
图
4)
，表明：
1
-
6
管几乎无
DNA
片段；从第七泳道开始出现
cDNA
片段，且
cDNA
长度逐渐变小；
7
-
10
的片段基本大于
500 bp
；
11
以后各管有小于
500 bp
的片段，为避免过多的小片
段与载体连接，保证文库的全长率，舍弃
10
以后
的
cDNA
产物，收集合并
7
、
8
、
9
、
10
这
4
产物。
用于后续实验。
图
4
分级分离后
cDNA
电泳图
注
: M: 1 kb DNA mareker; 1
-
15:
分级分离后各管
cDNA
Figure 4 Electrophoresis of dscDNA after size fractionation
Note: M: 1 kb DNA mareker; 1
-
15: represent the dscDNA
after size fractionation
1.4 cDNA
文库质量鉴定
在
3
个
cDNA
与
λTriplEx2
载体连接反应中，
根据计算所得文库滴度来判断，体系
A
连接效果最
佳。
cDNA
与载体的比例为
0.5:1
，对各稀释度噬菌
斑数计数后，按照文库滴度公式计算得到初始文库
滴度为
2.25×10
6
pfu/mL (
图
5)
，扩增文库滴度为
2.65×10
9
pfu/mL
。蓝白斑计数测定得到文库重组率
为
95.13%
。
随机挑取
22
个噬菌斑进行
PCR
扩增鉴定，估
计文库的插入片段大小。电泳结果
(
图
6)
显示，其
图
5
初始文库滴度测定
Figure 5 Titer the primary library