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栗婷等
, 2011,
落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库构建及初步分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.26 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0026)
1190
胡萝卜
(Steward et al., 1958)
、拟南芥
(Ikeda-Iwai et
al., 2003)
、小麦
(Cuming and Lane, 1979)
、水稻
(Litts
et al., 1992)
、玉米
(Williams and Tsang, 1991)
、大豆
(
王萍等
, 2004)
、棉花
(Davidonis and Hamilton, 1983)
等多种植物通过体细胞胚胎发生获得再生植株；在
林木上，国内外已从冷杉属
(
Abies
)
、落叶松属
(
Larix
)
、云杉属
(
Picea
)
松属
(
Pinus
)
等多种针叶树中
获得体细胞胚。落叶松作为重要针叶造林用材树
种，在体细胞胚胎发生及再生体系方面已经取得重
要突破
(
吕守芳等
, 2005)
，但与很多被子植物相比，
其体细胞胚胎发生存在质量不高、发生数量低，且
难以同步化等关键技术问题，成为落叶松规模化无
性繁殖及遗传转化的瓶颈
(
吕守芳等
, 2004,
林业科
学研究
, 17(3): 392-404)
。亟需从植物体细胞胚胎发
生的机理及调控方面开展研究；目前，已分离与鉴
定了多种与体细胞胚发生相关的基因
(
张蕾等
, 2006;
Pullman and Webb, 1994; Palovaara et al., 2010)
。但
从体细胞诱导成胚性细胞、再由胚性细胞发育成体
细胞胚是一个复杂的过程，迄今，对植物体细胞胚
胎分子机理的研究相对薄弱，尤其是针叶树体细胞
胚机理研究极少。
利用现代功能基因组学手段是开展分子生物学
研究的重要方式。构建全长
cDNA
文库可以高效、
大规模获得基因序列信息，对基因组庞大，近期内
尚不能进行全基因组测序的物种来说，是进行其功
能基因组研究的一条有效途径
(
毛新国等
, 2006)
。目
前，已有多种构建全长
cDNA
文库的方法，其中主
要有：
CAPture
法、
Oligo-capping
法、
SMART
(Switching Mechanism At 5
，
end of RNA Transcript
method/SMART method)
法、
Cap-jumping
法以及
Cap-trapper
法等。
SMART(Zhu et al., 2001; http://
www.clontech.com/images/PT3000-1.pdf)
技 术 是
Clontech
公司的一项专利，是目前国内应用最多、
较为成熟的一种全长
cDNA
文库构建技术，和目前
其它市场化的全长
cDNA
文库构建技术相比，有其
独特的优点：
SMARTScribe
TM
MMLV
逆转录酶的末
端转移酶活性以及双链
cDNA
的分级分离保证了连
接片段的全长率，此外，利用此方法构建文库时，
所需起始材料用量少
(0.025
-
1.0 μg
的
mRNA
或者
0.05
-
2.0 μg
的总
RNA)
且可实现定向克隆。该方法快
速、操作简单、经济。综合以上因素，本研究选用
SMART
技术构建落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文库。
本研究首次以日本落叶松
(
Larix leptolepis
)
胚
性细胞系
638
＃
原胚团和早期单胚为实验材料，利用
SMART
技术，构建落叶松体细胞胚胎全长
cDNA
文
库，进一步揭示落叶松体细胞胚胎发育分子机理，
为探索基因功能、表达谱研究奠定基础。也为研究
合子胚发生机理提供科学依据。
1
结果与分析
1.1
总
RNA
及
mRNA
的质量
RNA
质量的高低直接影响到文库的质量，提取
的总
RNA
经
1%
琼脂糖电泳检测，显示明显的
28S
、
18S
、条带，
28S
、
18S
条带亮度比约为
2:1
，表明
RNA
完整
(
图
1)
；
ND-1000
检测得
A260/A280
比值
均在
2.1
左右，
A260/A230
比值均在
1.8
以上
(
表
1)
，
说明
RNA
纯度高，无
DNA
、蛋白质及小分子的污
染；从各总
RNA
中取出
2 μL
，于
37
℃温浴
2h
以
上，电泳检测后与原
RNA
无明显区别，说明没有
RNase
的污染
(
图
2)
。纯化后的
mRNA1%
琼脂糖电
泳检测结果显示获得的
mRNA
呈均匀弥散状，表明
mRNA
无降解，质量好。
图
1
各时期材料总
RNA
电泳图
Figure 1 Electrophoresis of total RNA from three development
stage of embryogenic callus
1.2 mRNA
合成双链
cDNA
取
5μL
合成的双链
cDNA
于
0.8%
的琼脂糖凝
胶电泳检测，双链
cDNA
呈弥散状，弥散范围重点
分布在
0.5kb
-
2kb
之间
(
图
3)
，
Nano-Drop1000
检测
得，
A260/A280
比值为
1.86
，
A260/A230
比值为在
1.84
，浓度为
546.6 ng/μL
。这表明双链
cDNA
条带