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袁存权等
, 2011,
刺槐
SRAP-PCR
反应体系优化及引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.25 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0025)
1184
图
2
基本反应体系中各组分不同浓度对
SRAP-PCR
反应的影响
注
: M: DL2000 DNA Marker; 1
-
4: Mg
2+
浓度
; 5
-
8: dNTPs
浓度
; 9
-
12:
Taq
DNA
聚合酶量
; 13
-
16: primer
浓度
; 17
-
20: DNA
模板
浓度
;
各组分浓度见表
2
Figure 2 Effect of each component concentrations of SRAP-PCR patterns in basic reaction system
Note: M: DL2000 DNA marker; 1
-
4: Mg
2+
concentration; 5
-
8: dNTPs concentration; 9
-
12:
Taq
DNA polymerase concentration;
13
-
16: primer concentration; 17
-
20: DNA template; The reaction concentration are showed in table 2
聚合酶量为
2.0 U
时，背景较深，因此，选择
Taq
DNA
聚合酶量为
1.5 U
。
当
primer
浓度为
0.1~0.2 µmol/L
时，扩增条带数
目较少且亮度较低，随着浓度的增加，扩增条带数
目和清晰度均提高，但
0.3 µmol/L
和
0.4 µmol/L
扩
增结果无明显差别，考虑到引物浓度过高容易产生
引物二聚体和从经济角度考虑，选择
primer
浓度为
0.3 µmol/L
。
4
个
DNA
模板浓度均扩增出了较为清晰地条
带，且条带之间无显著差别，考虑到过低浓度的模
板
DNA
量容易造成扩增条带数目减少，而过高浓度
的
DNA
量则容易造成非特异性扩增产物的出现，选
择模板
DNA
量为
30 ng
。
综合考虑上述因素，最终确定
25 µL SRAP-PCR
反应总体系中各主要组分的最优组合为：
Mg
2+
2.5 mmo1/L
，
dNTPs 0.2 mmol/L
，
Taq
DNA
聚合酶
1.5 U
，
primer 0.3 µmol/L
，模板
DNA 30 ng
。
1.3
优化反应体系的验证及引物筛选
利用优化的刺槐
SRAP-PCR
反应体系，以航天
诱变刺槐根部和叶片
DNA
、
3
个刺槐品种
DNA
和
3
份普通二倍体刺槐单株材料
DNA
为模板，选用引物
组合
em4/me9
进行
SRAP-PCR
优化体系验证
(
见图
3)
。
从图中可以看出，各品种均扩增出了清晰稳定且多
态性较为丰富的条带。表明优化后的反应体系适合
于刺槐的
SRAP-PCR
反应。
图
3
引物
em4/me9
对
8
份刺槐材料
DNA
的
PCR
扩增
注
: M: DL2000 DNA Marker; 1:
普通二倍体刺槐单株
1; 2:
航天诱变刺槐根
DNA
样品
; 3:
航天诱变刺槐叶片
DNA
样品
;
4:
普通二倍体刺槐单株
2; 5:
普通二倍体刺槐单株
3; 6:
二
季红花槐
; 7:
箭杆
1
号
; 8:
鲁刺
9
号
Figure 3 PCR amplifications of 8
Robinia pseudoacacia
L.
DNA template by primer em4/me9
Note: M: DL2000 DNA marker; 1: individualplant 1; 2: DNA
from the roots of space mutagenesis of
Robinia pseudoacacia
L.; 3: DNA from the leaves of space mutagenesis of
Robinia
pseudoacacia
L.; 4: individualplant 2; 5: individualplant 3; 6:
Robinia hispida L.; 7: Jiangan 1; 8: Luci 9
利用优化的刺槐
SRAP-PCR
反应体系对
169
个引
物组合进行初步筛选和重复筛选，最终获得条带清
晰、稳定、重复性好以及多态性丰富的引物组合
35
个。具体引物组合为：
em1/me3
、
em1/me6
、
em1/me10
、
em2/me4
、
em2/me5
、
em2/me6
、
em2/me9
、
em2/me11
、
em3/me1
、
em3/me4
、
em3/me9
、
em3/me10
、
em3/me13
、
em4/me5
、
em4/me9
、
em4/me10
、
em4/me11
、
em4/me12
、
em4/me13
、
em5/me5
、
em5/me6
、
em5/me9
、
em5/me10
、
em5/me12
、
em5/me13
、
em6/me4
、
em6/me6
、
em6/