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袁存权等
, 2011,
刺槐
SRAP-PCR
反应体系优化及引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.25 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0025)
1183
单，重复性好，以及引物具有通用性等优点
(Li and
Quiros, 2001)
。在林木中国内外学者利用
SRAP
标记
技术进行了包括体系优化、遗传多样性分析、杂种
鉴定、遗传连锁图谱构建以及
QTL
分析等在内的大
量工作，物种涉及杨树
(Wang et al., 2010)
、柑橘
(Osman et al., 2010;
吴鑫等
, 2008)
、红松
(Chen et al.,
2010)
、糖槭
(Sreedhar et al., 2008; 2009)
、芭蕉
(Muhammad et al., 2010)
、美国脐橙
(An et al., 2008)
、
菠萝
(
邱文武等
, 2008)
、龙眼
(
赵玉辉等
, 2009)
、落羽
杉属树木
(
於朝广等
, 2009)
、葡萄
(
郭大龙等
, 2010)
、
荔枝
(
昝逢刚等
, 2009)
、甘薯
(
吴洁等
, 2005;
李爱贤
等
, 2008)
等。
目前，对于刺槐树种而言，开发的可供利用的
SSR
引物仅为
21
条
(Lian et al., 2002, 2004; Kentaro et
al., 2008)
，因而很难满足实际需要，而
AFLP
技术尽
管引物具有通用性，但是其操作复杂，且成本较高，
这些因素极大地限制了刺槐分子标记辅助育种工
作的开展。本研究采用正交试验设计同时结合单因
素试验对刺槐
SRAP-PCR
反应体系中各主要成分
(Mg
2+
, dNTPs,
Taq
DNA
聚合酶
, primer
浓度和模板
DNA
量
)
进行优化，在此基础上利用优化的刺槐
SRAP-PCR
体系进行引物筛选，最终建立了适合刺
槐的
SRAP-PCR
反应体系。为利用
SRAP
标记技术进
行刺槐种质资源遗传多样性分析、指纹图谱构建以
及刺槐分子标记辅助育种研究奠定了基础。
1
结果与分析
1.1
正交试验设计筛选
以普通二倍体刺槐
DNA
为模板，利用
me13/em1
引物组合对正交试验设计各组合反应体系进行扩
增
(
见图
1)
。从图中可以看出，由于
Mg
2+
、
dNTPs
、
Taq
DNA
聚合酶、
primer
以及模板
DNA
浓度组合的
不同，扩增结果之间表现出明显的差异。其中组合
1
、
2
、
3
、
4
、
6
、
8
、
11
、
12
、
16
无扩增条带或者扩
增条带较弱，分析
1
、
2
、
3
、
4
组合，
Mg
2+
处于最低
浓度
1.5 mmol/L
，而其它因素处在不同的水平，组
合
6
和
8 Mg
2+
浓度也处于相对较低水平
2.0 mmol/L
，
组合
6
、
11
、
16
的
Taq
DNA
聚合酶处于最低水平
0.5
U
，组合
12
的
primer
浓度处于最低水平
0.1 µmol/L
。
组合
7
和
14
虽然扩增出了条带，但条带数目较少。
组合
9
、
10
、
13
、
15
均扩增出了较为清晰地条带，
而在这些组合中
dNTPs
和
DNA
模板各个浓度梯度
图
1 SRAP-PCR
正交试验设计电泳
注
: M: DL2000 DNA Marker;
编号
1
-
16
分别对应表
3
中各处
理组合
Figure 1 Electrophoresis result of SRAP-PCR orthogonal
design
Note: M: DL2000 DNA marker; Number 1 to 16 refers to each
treatment combinations in table 3
均有，
Mg
2+
和
Taq
DNA
聚合酶量处于较高水平。
综合上述结果来看，
Mg
2+
和
Taq
DNA
聚合酶量
为影响刺槐
SRAP-PCR
的关键因素，低浓度的
Mg
2+
和
Taq
DNA
聚合酶量不利于扩增，在保证基本扩增
的前提下，
dNTPs
和
DNA
模板浓度并不是影响
PCR
的关键因素。
根据对扩增条带数目多少、清晰度、背景强弱
等进行综合评价，初步筛选出组合
9
和
10
为最优组
合，其次为组合
15
，
13
。
综合分析初步确定基本反应体系为
Mg
2+
2.5 mmo1/L
，
dNTPs 0.2 mmol/L
，
Taq
DNA
聚合酶
1.5 U
，
primer 0.4 µmol/L
，模板
DNA 30 ng
。
1.2
单因素实验
利用正交试验设计得出的基本反应体系，以普
通二倍体刺槐
DNA
为模板，在保持其它因素不变的
情况下依次变换单一因素，利用
me2/em5
引物组合
进行扩增
(
见图
2)
。从图中可以看出，随着
Mg
2+
浓度
的增长，扩增产物在不断增加，当
Mg
2+
浓度达到
2.5 mmo1/L
时，扩增条带基本稳定，从经济角度考虑
结合正交试验结果，选择
Mg
2+
浓度为
2.5 mmo1/L
。
当
dNTPs
浓度为
0.1
和
0.2 mmol/L
时，扩增条带
清晰且数目较多，随着
dNTPs
浓度的增加，扩增条
带数目和清晰度逐渐下降。考虑到
dNTPs
浓度过低
将会降低扩增产物量和扩增稳定性，结合正交试验
结果选择
dNTPs
浓度为
0.2 mmol/L
。
当
Taq
DNA
聚合酶量为
0.5~1.0 U
时，扩增条带
数目较少，且不清晰，当
Taq
DNA
聚合酶量为
1.5~2.0
U
时，扩增条带数目较多且清晰稳定，但是
Taq
DNA