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袁存权等
, 2011,
刺槐
SRAP-PCR
反应体系优化及引物筛选
,
分子植物育种
Vol.9 No.25 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0025)
1185
me10
、
em6/me11
、
em6/me12
、
em6/me13
、
em9/me11
、
em9/me13
、
em11/me11
、
em12/me11
。
2
讨论
对于刺槐的遗传多样性研究、亲缘关系分析以
及种质资源鉴定等方面目前可供利用的分子标记
主要有
RAPD
、
ISSR
、
AFLP
、
SSR
，与
SRAP
分子
标记相比，
RAPD
的重复性和可靠性较低；
AFLP
步
骤繁琐、成本较高，且不能区分显隐性状；
ISSR
是
基于
SSR
引物序列的一种分子标记，需要花费大量
成本来开发引物；
SSR
虽然稳定性较高，操作简单，
为一种可靠的共显性标记，但是其需要花费高成本
来开发大量的特异性引物，在刺槐树种中，目前开
发的可供利用的
SSR
引物仅为
21
条，因而很难满足
实际需要。由于
SRAP
分子标记不需要已知序列信
息，引物具有通用性，且上下游引物可相互配对组
合，多数
SRAP
标记在基因组中分布均匀，为一种
共显性标记，因此在刺槐的相关分子生物学研究等
方面将会体现出较大的价值
(
孙佳琦等
, 2010)
。
本研究通过正交试验设计结合单因素设计对刺
槐
SRAP-PCR
反应体系进行优化，既利用了正交试
验设计考虑各组分间相互影响和有效降低工作量的
优点，同时利用了单因素试验简单快捷的优点，使
优化获得的体系更加准确，通过单因素试验得到的
结果与正交试验得到的最优组合基本吻合。优化获
得的刺槐
SRAP-PCR
反应体系为
25 µL
总体系中各
主要组分为：
Mg
2+
2.5 mmo1/L
，
dNTPs 0.2 mmol/L
，
Taq
DNA
聚合酶
1.5 U
，
primer 0.3 µmol/L
，模板
DNA
30 ng
。郭大龙等
(2010)
采用同样的方法对葡萄
SRAP-PCR
反应体系进行了优化，刘龙洲等
(2009)
、
王燕青和季孔庶等
(2009)
、邹小云等
(2010)
、於朝广
和殷云龙等
(2009)
、陈万胜等
(2008)
采用正交试验设
计分别对甜瓜、牡丹、花生、落羽杉属树木、烟草
SRAP-PCR
体系进行了优化，均得到了适合于各自
材料的最佳
SRAP-PCR
体系，表明利用这种方法进
行体系优化是有效地。
本研究优化获得的
SRAP-PCR
最佳反应体系经
验证结果稳定、可靠，在此基础上筛选获得了适合
于刺槐的扩增条带清晰，重复性好以及多态性丰富
的引物
35
对，这将为利用
SRAP
分子标记开展刺槐
遗传多样性分析、指纹图谱构建、分子标记辅助育
种以及基因克隆等研究工作奠定基础。
3
材料与方法
3.1
供试材料
本实验选用普通二倍体刺槐为体系优化材料，
采自北京市延庆县米家堡苗圃。利用刺槐品种二季
红花槐、箭杆
1
号、鲁刺
9
号，航天诱变刺槐，以及
普通二倍体刺槐不同单株材料
3
份
(
单株材料
1, 2, 3)
来验证优化后的反应体系，其中二季红花槐、箭杆
1
号、鲁刺
9
号采自山东临沂费县大青山林场，航天
诱变刺槐
(
经实践八号育种卫星搭载返地后种植获
得的实生苗
)
采自北京市延庆县风沙源苗圃，普通二
倍体刺槐单株材料采自北京市延庆县米家堡苗圃。
3.2
实验试剂
DNA
聚合酶、
dNTPs
、
DL2000 DNA Marker
等
分别购白
Promega
、
Biodee
、
TaKaRa
公司，
SRAP
引
物根据
Li
等
(Li and Quiros, 2001)
提出的原则设计，
由上海捷瑞生物工程有限公司合成，具体序列信息
见表
1
。
3.3
基因组
DNA
提取
采集刺槐幼嫩叶片和根，利用天根生化科技
(
北
京
)
有限公司的新型植物基因组
DNA
提取试剂盒依
照操作指南进行基因组
DNA
提取。提取到的
DNA
采用琼脂糖凝胶电泳和
NanoVue
超微量分光光度计
检测完整性和质量。
3.4 SRAP-PCR
反应条件
SRAP-PCR
扩增采用如下程序：
94
℃
5 min
；
94
℃
l min
，
35
℃
l min
，
72
℃
1.5 min
，
5
个循环；
94
℃
1 min
，
50
℃
1 min
，
72
℃
1.5 min
，
35
个循环；
72
℃
10 min
，
10
℃保存。扩增产物在
8%
的聚丙烯
酰胺凝胶电泳中电泳，银染检测并用数码相机照相。
3.5 SRAP-PCR
反应体系优化
刺槐
SRAP-PCR
反应体系优化正交试验设计所
用引物组合为
me13/em1
，单因素试验所用引物组合
为
me2/em5
。先利用
L
16
(4
5
)
正交试验设计进行
5
因素
4
水平的筛选分析，因素水平及正交试验设计见表
2
和表
3
。在初步筛选获得较优组合的基础上进行单
因素试验，基本反应体系为
25 µL
总反应体系中包含
Mg
2+
2.5 mmo1/L
，
dNTPs 0.2 mmol/L
，
Taq
DNA
聚
合酶
1.5 U
，
primer 0.4 µmol/L
，模板
DNA 30 ng
，保
持其它因素不变的情况下依次变换单一因素，筛选