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曾兴莹等
, 2011,
花椰菜与黑芥体细胞杂种不同世代甲基化变异
MSAP
分析
,
分子植物育种
Vol.9 No.20 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0020)
1155
其中表中
X
位点代表的是未甲基化的单态性
CCGG
位点。
A
类型代表的是有胞嘧啶甲基化的单
态性位点。
B
类型代表的是子代与亲本之一带型一
致的位点。而
C
、
D
类型代表子代与两个亲本带型不
一致的位点，即子代新出现的带型。从表中可以看
出，
B
类位点最为丰富，占所有位点的
55%
以上，而
与亲本相比发生变异的位点在
10.7%
～
15.2%
之间。
2
讨论
许多研究表明，不同的
DNA
胞嘧啶甲基化变异
水平能够导致不同的基因表达和转录水平的变化。
(Seheb et al., 2006)
。而通过研究发现，杂交后代间
基因组
DNA
甲基化与亲本相比有明显的差异，与亲
本相比不仅有些位点表现为过甲基化，还有一些表
现为去甲基化。本文以花椰菜和黑芥的体细胞杂种
的回交后代以及自交后代为材料，以
MSAP
法检测
了胞嘧啶甲基化水平以及甲基化变异模式。
实验结果显示：回交后代和自交后代的总体甲
基化水平为
37.5%
、
39.3%
、
37.7%
和
36.7%
、
36.6%
、
36.4%
。各世代之间甲基化水平没有明显的差异，
可能是由于本实验所用的材料都是回交和自交早
代的材料，基因组还都处于一个相对不稳定的状
态，不仅世代间
DNA
甲基化变异不明显，而且回交
后代与自交后代之间总体的甲基化水平也无明显
的差异。回交后代和自交后代的半甲基化水平分别
为
6.7%
、
6.5%
、
6.2%
和
6.7%
、
6.5%
、
6.2%
，全甲
基化水平分别为
19.0%
、
19.7%
、
19.0%
和
18.0%
、
18.0%
、
18.3%
，可以看出不论是回交后代还是自交
后代的甲基化水平是以全甲基化水平为主要方式，
而且回交后代的全甲基化水平高于自交后代，表明
自交后代的甲基化遗传机制尚不稳定。
本研究结果表明：花椰菜和黑芥的体细胞杂种
的回交后代和自交后代甲基化和非甲基化变异位
点占所有甲基化位点的
40.8%
和
42.5%
，说明回交后
代和自交后代间的甲基化位点大部分可以稳定遗
传，在所有的变异位点中主要以
B
型为主，其余
A
、
C
、
D
三种类型较少，表明
DNA
甲基化变异是有规
律的，它会倾向于某一个亲本类型，这可能是杂交
过程中某一亲本的优势。
目前植物远缘杂交引起基因组
DNA
甲基化水
平及模式在小麦一黑麦杂种
(Houehins et al., 1997)
、
拟南芥属
(Comai, 2000; Lee et al., 2001; Madlung et
al., 2002)
和小麦属
(
刘宝等
, 2000,
多倍体小麦物种
形成可诱发稳定遗传的胞嘧啶甲基化变异
,
自然科
学进展
, 8: 710-715; Shaked et al., 2001; Kashkush et
al., 2003)
中所取得的一系列的研究成果，可以说明
远缘杂种世代间表观遗传变异不仅与
DNA
序列变
化有关而且与
DNA
胞嘧啶甲基化变异有关。
3
材料与方法
3.1
供试材料
试材为黑芥
(
B. nigra
, BB, 2n=16)
与花椰菜品种
(
B. oleracea var. botrytis
, CC, 2n=18)
及其体细胞杂
种后代，分别
S2
、
S3
、
S4
代及以花椰菜为回交亲本，
得到的
BC1
、
BC2
、
BC3
代。全部由北京市农林科
学院蔬菜研究中心生物技术研究室提供。
3.2
方法
DNA
的提取：取供试材料的叶片采用
SDS
法提
取植物总
DNA
，并用紫外分光光度计检测其浓度。
MSAP
法检测基因组的甲基化变异，其中所有的接
头、预扩增引物及选择性扩增引物的序列以
Vos
等
(Vos et al., 1995)
序列为参照，详见表
3
。所有序列由
北京赛百盛基因技术有限公司合成。用
Eco
R
Ⅰ
/
Hpa
Ⅱ和
Eco
R
Ⅰ
/
Msp
Ⅰ两组限制性内切酶对
DNA
样品分
别进行酶切。
Taq
酶和
PCR
反应体系试剂均购自北京
全式金生物技术有限公司提供。酶切连接体系
(20 μL)
包括：
5 μL
模板
DNA
，
2.5 μL 10
×
Tango Buffer
，
2.5 μL
ATP
，
1 μLBSA
，
2 μL
Eco
R
Ⅰ接头，
2 μL
Hpa
Ⅱ
/
Msp
Ⅰ
接头，
2 μL
Eco
R
Ⅰ，
2 μL
Hpa
Ⅱ
(
或
Msp
Ⅰ
)
，
1 μL T4
连接酶，其余用
ddH
2
O
补齐。反应混合液在
37
℃反
应
6 h
，
8
℃
4 h
，最后
4
℃反应过夜。然后酶切连接
产物用
ddH2O
稀释
10
倍后作为预扩增反应的模板，
其中模板量为
4 μL
。最后将预扩增所得的
PCR
产物
稀释
50
倍后再次用于选择性扩增反应，并进行变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和硝酸银染色检测。