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葛亚英等
, 2011,
丽穗凤梨
ISSR-PCR
反应体系的优化和确立
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.119 pp.1864-1869 (doi: 10.5376/ mpb.cn.2011.09.0119)
1866
时扩增带型基本一致，但
0.2 mmol/L
时扩增条带最
清晰，因此
dNTPs
浓度变化对
PCR
产物影响较大，
最终
dNTPs
最佳浓度为
0.2 mmol/L (
图
5)
。
图
4
引物浓度对
ISSR
反应的影响
注
: M: 100 bp DNA marker; 1~6:
引物浓度依次为
0.5 μmol/L, 0.75μmol/L, 1.0 μmol/L, 1.25 μmol/L, 1.5 μmol/L
和
2.0 μmol/L
Figure 4 The effect of primer concentrations on ISSR reaction
Note: M: 100 bp DNA marker; 1~6: Primer concentration is
0.5 μmol/L, 0.75 μmol/L, 1.0 μmol/L, 1.25 μmol/L, 1.5 μmol/L
and 2.0 μmol/L, respectively
图
5 dNTPs
浓度对
ISSR
反应的影响
注
: M: 100 bp DNA marker; 1~5: dNTPs
浓度为
0.05 mmol/L,
0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L
和
0.6 mmol/L
Figure 5 The effect of dNTPs concentrations on ISSR reaction
Note: M: 100 bp DNA marker; 1~5: dNTPs concentration is
0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L and
0.6 mmol/L, respectively
1.2.5 Mg
2+
浓度对
ISSR-PCR
的影响
Mg
2+
浓度对
ISSR-PCR
反应的特异性及扩增
条带数的影响较大
(
图
6)
。随着
Mg
2+
浓度增加，扩
增条带数先增加后减少，当
Mg
2+
浓度为
1.5 mmol/L
时扩增产物最为丰富，且条带最清晰。随着浓度增
加，条带逐渐模糊，当浓度为
2.5 mmol/L
时产生非
特异性扩增。因此，最终确定为
1.5 mmol/L
的
Mg
2+
浓度为最适浓度。
1.3 ISSR-PCR
反应体系的确立及稳定性鉴定
根据上述各影响因子试验结果，最终确定优化
后的
20 uL
反应体系中：
10× PCR Buffer 2.0 μL
，
25 mmol/L MgCl
2
1.2 μL
，
10 mmol/L dNTPs 0.4 μL
，
5U/μL
Taq
酶
0.25μL
，
10μmol/L
引物
3.0μL
，
20ng/μL
模板
1.5 μL
，
ddH
2
O
补充至
20 μL
。应用上述反应体系，
进行引物筛选，筛选得到的引物随机选取
2
条，对
23
个品种进行
PCR
扩增
(
图
7)
，引物
U808
和
U834
对每份
DNA
样品均能扩增出条带清晰、多态性丰
富的
DNA
片段，说明该
ISSR-PCR
反应体系稳定
可靠，适用于丽穗凤梨基因组
DNA
的
ISSR-PCR
扩增反应。
图
6 Mg
2+
浓度对
ISSR
反应的影响
注
: M: 100 bp DNA marker; 1~4: Mg
2+
浓度依次为
1.0 mmol/L,
1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L
和
2.5 mmol/L
Figure 6 The effect of Mg
2+
concentrations on ISSR reaction
Note: M: 100 bp DNA marker; 1~4: Mg
2+
concentration is
1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L and 2.5 mmol/L,
respectively
图
7
引物
U808
和
U834
在
23
个丽穗凤梨品种中的扩增
注
: A:
引物
U808; B:
引物
U834; M: 100 bp DNA marker
Figure 7 ISSR profiles of 23 cultivars in
Vriesea
cultivars
amplified by primer U808 and U834
Note: A: Primer U808; B: Primer U834; M: 100 bp DNA
marker
2
讨论
ISSR-PCR
反应受反应组分变化影响较大，此
外，不同植物种类的
PCR
扩增反应体系存在一定的