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葛亚英等, 2011, 丽穗凤梨 ISSR-PCR 反应体系的优化和确立, 分子植物育种(online) Vol.9 No.119 pp.1864-1869 (doi: 10.5376/ mpb.cn.2011.09.0119)
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差异(陈丽静等, 2011; 刘立军等, 2006)。目前尚无
丽穗凤梨 ISSR 标记的相关报道，因此，建立丽穗
凤梨 ISSR 优化体系是必要的。大多数研究者对植
物进行 PCR 扩增前，都会对该植物进行反应体系的
优化，一般采取两种方法：第一是运用正交试验进
行优化设计(张飞等, 2009; 李健等, 2011; 邹小云等,
2010)，但是其有可能得到的实验条件并不是最优条
件；第二是采用单因子试验(陈丽静等, 2011; 杜萍
和崔宝凯, 2011)，对影响 ISSR-PCR 的各个反应因
子进行单独的梯度试验，找出最佳反应条件。本试
验采用第二种方法，最终确立了丽穗凤梨
ISSR-PCR 最佳反应体系。
关于 ISSR 的反应体系优化的报道(张玉星等,
2011; 吕岩桢等, 2011) 很多，成分用量的变化对
ISSR-PCR 扩增结果影响很大。李萍等(2007)对光萼
荷属凤梨与其近源属亲缘关系进行研究时采用的
是 20 μL ISSR 反应体系，其中含 10× PCR Buffer
2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 2.0 μL、10 mmol/L dNTPs
0.8μL、5U/μLTaq酶 0.2μL、10μmol/L 引物1.0μL、10 ng/μL
模板 1.0 μL。然而，本试验优化后的丽穗凤梨 ISSR
体系中，除 PCR Buffer 含量与其一致外，其余组分
含量与光萼荷属凤梨均存在差异。本试验在优化
ISSR-PCR 扩增体系时发现，各组分(Taq DNA 聚合
酶, 模板 DNA, 引物浓度, dNTPs, Mg 2+ 浓度)作为
ISSR 扩增底物，有一个相对适宜的用量范围，浓度
过低，不能满足扩增要求；浓度过高，又降低各组
分的活性，影响扩增效果。因此，进行 ISSR 体系
的优化是获得较好研究结果的关键所在。
目前尚无丽穗凤梨品种资源多样性研究。通过
筛选得到的其中两条引物对丽穗凤梨 23 个品种的
ISSR 扩增结果分析，每个品种均能扩增出清晰条
带，引物 U808 能扩增出 13 个清晰 DNA 位点，引
物 U834 能扩增出 10 个清晰 DNA 位点，并且多态
性均达 100% 。验证结果证明本研究确立的
ISSR-PCR 反应体系稳定、可靠，同时也说明 ISSR
分子标记适合对丽穗凤梨进行遗传多样性分析。这
一优化的反应体系为进一步利用 ISSR 分子标记技
术对丽穗凤梨资源鉴定、分类和分子遗传图谱的构
建及分子标记辅助育种等分子生物学研究奠定了
良好的基础。
3 实验材料与方法
3.1 实验材料
供试材料为丽穗凤梨属 23 个品种，2010 年采自
浙江省农科院花卉研究开发中心观赏凤梨资源圃。
3.2 基因组 DNA 的提取和检测
参照 Murray 和 Thomopson (1980)方法采用
CTAB 法提取丽穗凤梨基因组 DNA，0.8%琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 质量和浓度，
并统一稀释至 20 ng/μL，保存于- 20℃备用。
3.3 ISSR-PCR 扩增
PCR 扩增选用的引物根据 British Columbia 大
学公布的 ISSR 引物序列，由上海生工有限公司合
成；Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2 、10× Buffer
以及 100 bp DNA marker 均购自杭州鼎国生物技术
有限公司。扩增程序是：首先 94℃预变性 4 min；
再 94℃变性 30 s，56℃复性 45 s，72 ℃延伸 60 s，
共 40 个循环；然后 72℃延伸 6 min，最后 4℃保存。
PCR 扩增反应在美国 ABI Applied Biosystems 2720
型 PCR 扩增仪上进行。
3.4 ISSR-PCR 反应体系的优化试验设计
按照基本扩增反应体系 (20 uL 反应体系中 :
10× PCR Buffer 2.0 μL, 25 mmol/L MgCl 2 1.0 μL,
10 mmol/L dNTPs 0.8 μL, 5 U/μL Taq 酶 0.2 μL,
10 μmol/L 引物 2.0 μL，20 ng/μL 模板 1.0 μL) ，对
Taq DNA 聚合酶用量、模板 DNA 含量、引物浓度、
dNTPs 和 Mg2+ 浓度 5 个影响 ISSR-PCR 扩增的主要
因素进行单因子试验，各反应参数作 4~6 个水平的梯
度优化(表 1)， PCR 扩增产物采用 1.2%的琼脂糖凝
胶电泳检测，确定各成分的最佳浓度，每个优化好了
的参数直接用于下一个优化参数的反应体系中。
表 1 ISSR 反应体系优化设计
Table 1 Design of optimal ISSR reaction system
反应物
Reactant
反应物浓度
Reactant concentration
Taq DNA 聚合酶浓度
(U)
The concentration of Taq
DNA polymerase (U)
0.75 1.0 1.25 1.5 1.75 -
模板 DNA 浓度(ng/μL)
The concentration of
template DNA (ng/μL)
0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0
引物浓度(μmol/L)
The concentration of
primers (μmol/L)
0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 2.0
dNTPs 浓度(mmol/L)
The concentration of
dNTPs (mmol/L)
0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 -
MgCl2 浓度(mmol/L)
The concentration of
MgCl2(mmol/L)
1.0 1.5 2.0 2.5 - -
3.5 ISSR 反应体系引物筛选及检测
根据优化的 ISSR 反应体系，选用 2 个品种对
48 条 ISSR 引物进行 PCR 扩增，扩增产物采用 6%
非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，确定多态性较