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葛亚英等
, 2011,
丽穗凤梨
ISSR-PCR
反应体系的优化和确立
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.119 pp.1864-1869 (doi: 10.5376/ mpb.cn.2011.09.0119)
1865
DNA
样品用量少、实验成本低、操作简单，而且实
验多态性高、信息量大、重复性好，目前在品种鉴
定、居群遗传学、系统学比较与物种分类以及物种
的进化关系等研究中已被广泛应用，并开始在植物
遗传多样性研究中运用
(
周延清等
, 2008)
。目前已成
功用于菊花
(
缪恒彬等
, 2008)
、兰花
(
吴振兴等
,
2008)
、万寿菊
(
曾丽等
, 2010)
等观赏植物的遗传多
样性、品种鉴定或指纹图谱构建等研究。李萍等
(2007)
运用
ISSR
对光萼荷属凤梨与其近源属亲缘
关系进行分析研究，但未见对其反应体系进行优
化。虽然
ISSR-PCR
具有重复性高等优点，但不同
反应体系产生的结果也有可能不同
(
吕岩桢等
,
2011)
，甚至同一种植物在不同的试验条件下其研究
结果都有差异
(
柴丹丹等
, 2008)
。同一反应体系在不
同的实验条件下，针对不同属的
DNA
模板对扩增
效果的影响较大，因此，对丽穗凤梨
ISSR-PCR
体
系进行优化是必要的。
本研究提取丽穗凤梨种质资源叶片的基因组
总
DNA
，并对
ISSR
反应体系中主要组分
Taq
DNA
聚合酶浓度、模板
DNA
浓度、引物浓度、
dNTPs
浓度以及
Mg
2+
浓度等进行优化，所确立的
ISSR
反
应体系为进一步利用
ISSR
标记技术开展丽穗凤梨
种质资源遗传多样性研究、连锁遗传图谱构建和分
子标记育种等方面奠定重要基础。
1
结果与分析
1.1
丽穗凤梨基因组的
DNA
提取
将用
CTAB
法提取叶片得到的
DNA
通过琼脂
糖跑胶和分光光度计来测其质量和浓度，结果
DNA
条带清晰，杂质含量较少，可以满足
ISSR
的实验
要求
(
图
1)
。
图
1
丽穗凤梨
23
份样品
DNA
提取
Figure 1 The DNA extracted from 23 samples of
Vriesea
Bromeliads
1.2
丽穗凤梨
ISSR-PCR
体系的优化
1.2.1
Taq
DNA
聚合酶用量对
ISSR-PCR
的影响
通过
5
种不同
Taq
DNA
聚合酶用量比较
(
图
2)
。
20 uL
反应体系中，
Taq
DNA
聚合酶用量在
0.75 U
时，扩增条带比较弱，且条带数少，当
Taq
酶用量
为
1.0~1.75 U
时，均能扩增出明显条带，在
1.25 U
时扩增条带最清晰，因此，
Taq
酶用量在
1.25 U
时
为最佳。
1.2.2
模板
DNA
用量对
ISSR-PCR
的影响
试验设置模板
DNA
终浓度梯度为
0.5 ng/μL
、
1.0 ng/μL
、
1.5 ng/μL
、
2.0 ng/μL
、
3.0 ng/μL
、
4.0 ng/μL
(
图
3)
，结果模板
DNA
用量在
0.5 ng/μL
时扩增条
带较模糊，
1.0~4.0 ng/μL
时均能扩增出清晰带
型，通过多次重复比较试验，且从经济角度考虑，
1.5 ng/μL
的模板用量可以满足丽穗凤梨
ISSR-PCR
反应的要求。
图
2
Taq
DNA
聚合酶用量对
ISSR
反应的影响
注
: M: 100 bp DNA marker; 1~5:
Taq
DNA
聚合酶用量分别
为
0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U
和
1.75 U
Figure 2 The effect of different
Taq
DNA Polymerase
concentrations on ISSR reaction
Note: M: 100 bp DNA marker; 1~5:
Taq
DNA Polymerase
concentration is 0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U and 1.75 U,
respectively
图
3 DNA
浓度对
ISSR
反应的影响
注
: M: 100 bp DNA marker; 1~6: DNA
浓度依次为
0.5 ng/μL,
1.0 ng/μL, 1.5 ng/μL, 2.0 ng/μL, 3.0 ng/μL
和
4.0 ng/μL
Figure 3 The effect of DNA concentrations on ISSR reaction
Note: M: 100 bp DNA marker; 1~6: DNA concentration is
0.5 ng/μL, 1.0 ng/μL, 1.5 ng/μL, 2.0 ng/μL, 3.0 ng/μL and
4.0 ng/μL, respectively
1.2.3
引物浓度对
ISSR-PCR
的影响
试验中引物浓度的变化对产物的多少和条带
的亮度影响较大
(
图
4)
，引物浓度在
0.5~1.0 μmol/L
时虽然能扩增出产物，但是条带数少且有些扩增条
带较弱；
1.25~2.0 μmol/L
时均能扩增出清晰的条带，
经重复比较，以
1.5 μmol/L
时，反应最稳定，条带
清晰，故将引物浓度确定为
1.5 μmol/L
。
1.2.4 dNTPs
浓度对
ISSR-PCR
的影响
当
dNTPs
浓度为
0.05 mmol/L
和
0.6 mmol/L
时
没有扩增条带；
0.1 mmol/L
时条带缺失现象严重，
多数条带模糊不清；
dNTPs
浓度为
0.2~0.4 mmol/L