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张双玲等
, 2011,
酶解法制备植物叶绿体
DNA(cpDNA),
分子植物育种
(online) Vol.9 No.115 pp.1843-1846 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0115)
1845
图
3
酶解法制备的小麦和大豆
cpDNA
注
: M:
Hin
d
Ⅲ
marker; 1:
小麦的
cpDNA; 2:
大豆的
cpDNA
Figure 3 Wheat and soybean cpDNA isolated by enzyme-lysed
method
Note: M:
Hin
d
Ⅲ
marker; 1: wheat cpDNA; 2: soybean
cpDNA
2
讨论
植物叶绿体
DNA
基因小，结构相对保守，同
时含有许多重要功能基因，在植物分子生物学研究
中有重要价值。植物叶片是所有组织中
cpDNA
含
量最高的，但仍需要大量的材料才能制备出满足实
验需求的
cpDNA
量，这给
cpDNA
研究带来很大的
不便。在植物
cpDNA
制备过程中，获得无细胞核
DNA
污染的完整叶绿体是最关键的步骤
(
朱小龙等
,
2003)
。由于不能采用液
N
冻干研磨，因为会造成
叶绿体的破坏，使细胞核
DNA
和
cpDNA
分离更加
困难。传统的制备方法中只能采用加石英砂研磨，
这样对植物细胞壁的破坏是非常有限的。纤维素酶
和果胶酶是植物原生质体制备过程中常用的酶，能
够酶解多数植物的细胞壁，但对植物的质膜和细胞
器没有破坏作用，采用纤维素酶和果胶酶处理植物
叶片，部分破坏细胞壁，再用石英砂研磨，可以有
效促进叶绿体的释放，进而有效提高
cpDNA
产量。
采用传统制备方法需要
4~10 g
左右的材料才能制
备出少量的可以通过凝胶分析
cpDNA
，这使叶绿体
转化体的早期鉴定无法进行。通过裂解酶液预处理
叶片，
1 g
材料就能制备出大量的
cpDNA
，这可以
使像叶绿体转化体的早期鉴定这类实验顺利进行。
加纤维素酶和果胶酶处理样品潜在的风险是
使样品中蛋白质含量提高，这不利于
DNA
的制备，
有可能降低
cpDNA
纯度，
cpDNA
纯度对后续实验
有着重要的影响，解决的办法是通过对叶绿体多次
洗涤。用限制性内切酶酶解
DNA
，从水解谱带能看
出其真实性和纯度，其电泳谱带与理论谱带基本一
致一方面表明其真实性，另一方面表明这样的
DNA
样品纯度上可以满足绝大多实验的需要，如果
DNA
样品中有一定的蛋白质污染，它是不能被酶切的。
从我们实验结果来看，用酶解法制备的
cpDNA
纯
度完全可以满足实验需要。
小麦和大豆是重要农作物，对它们
cpDNA
的
研究和认识有重要的应用价值。小麦的细胞壁通常
也被认为是很难酶解，为了验证酶解法是否适用这
样的植物材料，选择这两种材料制备
cpDNA
。从实
验结果看，用
4 g
材料也能制备出大量的
cpDNA
，
这表明该制备方法能适用于大多数植物。
3
材料和方法
3.1
植物材料
实验材料是烟草、小麦和大豆的叶片，烟草为
本 实 验 室 保 存 的 烟 草 品 种
SRI (
Nicotiana
tabacuumcv.
SRI)
。小麦为普通栽培品种鲁麦
21
，由
山东农业大学王洪刚教授提供。大豆为栽培夏大豆
品种临豆
8
号，从种子市场购买。
3.2
试剂组成
缓冲液
A
：
400 mmol/L
蔗糖，
50 mmol/L
Tris-HCl
，
20 mmol/L EDTA—Na
2
，
0.2% BSA, 0.2%
巯基乙醇，
pH
值为
7.8
，其中
0.2% BSA
和
0.2%
巯
基乙醇现用现加。缓冲液
B
：
400 mmol/L
蔗糖，
5 0
mmol/L Tris-HCl 0.1% BSA (
现用现加
)
，
pH 7.8
。缓
冲 液
C
：
100 mmol/L Tris-HCl
，
50 mmol/L
EDTA-Na
2
，
100 mmol/L NaCl, 0.2%
巯基乙醇
(
现用
现加
)
，
pH 7.2
。去壁酶液：
1%
纤维素酶
(Cellulase
R-10)
，
0.5%
果胶酶
(Macerozyme R-10)
，溶解于缓
冲液
A
中，贮于试剂瓶中，封口，于-
20
℃保存。
3.3
叶绿体
DNA
制备方法步骤
3.3.1
叶绿体的分离
取新鲜的黑暗中处理
48 h
叶片洗净，擦干
,
去除
中间叶脉，称
1-4 g
叶片剪成
1 cm
左右的小段分别
放入预冷
(0
℃
)
的碾钵中，加去壁酶液
2 mL,
以不加
酶液处理的传统制备方法作对照，
37
℃分解
2 h,
各加
入
5 mL
缓冲液
A
进行研磨匀浆
(
操作在冰上进行
)
。
用
50 μm
尼纶纱或
4~6
层纱布过滤浆液，过虑物再
研磨一次，再过滤，合并滤液，倒入离心管中。于
0
℃，
1 000 rpm (200 g)
离心
20 min
。取上清，分别转入新
离心管中，在
4 000 rpm (3 700 g)
离心
20 min
，弃上
清。在沉淀中再加入
5 mL
缓冲液
A
，用毛刷重新悬
浮叶绿体颗粒，在
4 000 rpm (3 700 g)
离心
20 min
，
弃上清，此沉淀为初步分离的叶绿体
(
视淀粉情况可