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张双玲等
, 2011,
酶解法制备植物叶绿体
DNA(cpDNA),
分子植物育种
(online) Vol.9 No.115 pp.1843-1846 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0115)
1846
再重复洗涤，白色物质为淀粉沉淀
)
。
3.3.2 DNase
处理，除去核
DNA
向离心管的沉淀中分别加入
400 μL
左右的缓
冲液
B
，再重新悬浮叶绿体沉淀，并加入适量的
DNase I
，使
DNaseI
终浓度为
250 mg/L
，在
37
℃下
水浴
20 min
，轻轻摇匀，加入
1 mol/L
EDTA-Na
2
(
终浓度为
0.2 mol/L),
终止酶解反应，在
4 000 rpm
(3 700 g)
离心
20 min
，收集沉淀。
3.3.3
裂解
向离心管的沉淀中加入预冷的缓冲液
C 500 μL
，
重悬叶绿体颗粒，然后再各加入
30 μL 20%
的
SDS
(
终浓度为
1%)
，
60
℃水浴，不时摇匀，直到被完全
裂解。
12 000 rpm
，离心
10 min
，取上层液。加等
体积氯仿：异戊醇
—24:1
，摇匀
5 min
，
12 000 rpm
离心
10 min
，取上层液，加
1/10
体积
5 mol/L NaCl
和等倍体积的异丙醇，
-20
℃放
2~3
个小时或过夜。
4
℃条件下
12 000 rpm
离心
15 min
，弃上清液，用
70%
乙醇洗涤，在温室下晾干，加
30 µL TE
缓冲液
溶解
DNA
，放入-
20
℃保存备用。
3.3.4
电泳检测
取
5 µL
提取的叶绿体
DNA
在
0.8 %
琼脂糖凝
胶上用
75 V
电泳
1 h
后
,
置于凝胶成像系统观察结
果并成像。
3.3.5
限制性内切酶酶切及电泳检测
所获得的
cpDNA
经限制性内切酶
Sam
Ⅰ
(TaKaRa
公司
)
酶切。反应体系总体积
50 μL
，其中
cpDNA
样品
10 μL, 10×Buffer 5 μL,
内切酶
20 U,
补
充无菌水至
50 μL, 37
℃保温过夜。
1.0 %
琼脂糖凝
胶上进行电泳检测。
作者贡献
张双玲是本研究项目的主要执行人，参与了实验设计，
完成论文初稿的写作。何道一是项目的设计者和负责人，指
导实验的实施，论文的写作和修改。全体作者都阅读并同意
最终的文本。
致谢
本研究由安徽省教育厅自然科学研究重点项目
(KJ2011A249)
资助。感谢本实验室硕士研究生陈丽萍协助了
部分实验工作。
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