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张双玲等
, 2011,
酶解法制备植物叶绿体
DNA(cpDNA),
分子植物育种
(online) Vol.9 No.115 pp.1843-1846 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0115)
1844
料多，这给一些有关
cpDNA
研究如叶绿体转化体
的鉴定带来不便。另一方面，
cpDNA
制备过程中易
受细胞核
DNA
的污染，一旦污染，
cpDNA
失去应
有的价值。解决这一问题的办法是首先制备出无核
基因组
DNA
污染的完整叶绿体，再行裂解叶绿体
制备
cpDNA (Frankel et al., 1979)
。目前虽有许多改
进的植物
cpDNA
制备方法报道
(
朱小龙
等
, 2003)
，
但
cpDNA
产量低的问题仍未解决。本文首次报道
酶解法制备
cpDNA
的方法，只需少量的植物材料
就可制备出满足实验需求的高质量的
cpDNA
。
1
结果与分析
1.1
酶解法制备的烟草叶绿体
DNA
在制备叶绿体
DNA
过程中，首先是破碎植物细
胞，制备出大量纯净的叶绿体。传统制备方法破碎
细胞主要采用研磨，研磨虽能破碎组织，但对植物
细胞壁的破坏不充分，细胞质难以释放出来，叶绿
体制备效率低。考虑到植物细胞壁主要由纤维素、
半纤维素及果胶等组成，参考植物原生质体的制备
方法，在研磨之前，采用
1%
纤
维素酶和
0.5%
果胶酶处理叶片
2 h
，在同等质
量的情况下，制备出的叶绿体明显多于传统方法制
备的，制备出的
cpDNA
的量也明显大于传统方法
(
见图
1)
。用传统方法制备
cpDNA
时，
4 g
叶片材
料提取的
cpDNA
溶于
30 µL TE
缓冲液，取
5 µL
进行电泳，经
EB
染色后，泳道上很难看见
DNA
；
图
1
酶解法制备的烟草叶绿体
DNA
注
: M:
λ-Hin
d
Ⅲ
marker; 1:
非酶解制备
(1 g
叶片材料
); 2:
非
酶解制备
(4 g
叶片材料
); 3:
酶解制备
(1 g
叶片材料
); 4:
酶
解制备
(4 g
叶片材料
)
Figure 1
Nicotiana tabacum
chloroplast DNA isolated by
enzyme-lysed method
Note: M:
λ-Hin
d
Ⅲ
marker; 1: cpDNA isolated by traditional
method (1 g fresh leaves); 2: cpDNA isolated by traditional
method (4 g fresh leaves); 3: cpDNA isolated by enzyme-lysed
method (1 g fresh leaves); 4: cpDNA isolated by enzyme-lysed
method (4 g fresh leaves)
采用酶法制备，
1 g
同样的材料，就能清晰地看见
DNA
样品。由此可见，酶法制备出的
cpDNA
的效
率远远高于传统方法的。由于制备出的叶绿体处于
超螺旋状态，电泳图中还不能准确判断其分子量的
大小，但清晰的一个条带说明样品纯度较好。
1.2
限制性内切酶酶切分析酶法制备的烟草叶绿体
DNA
的质量
从酶法制备的
cpDNA
琼脂糖凝胶电泳检测结果
可以看出，制备出的
cpDNA
只有一个条带，说明
制备出的
cpDNA
样品较纯净，但这还不能反映
cpDNA
样品的质量，只有经过内切酶酶切，从酶切
图谱的情况才能真实说明
cpDNA
样品的质量。用
限制性内切酶
Sam
Ⅰ酶切酶法制备的烟草
cpDNA
样品
14 h
，酶切结果见图
2
，从酶切的结果看，除
12 kb
和
9.9 kb
的条带没有出现外，呈现的其他带
型与报道的基本一致
(
Fluhr
and Edelman, 1981)
，说
明该方法制备的烟草
cpDNA
质量可靠。
1.3
酶解法制备的小麦和大豆的叶绿体
DNA
去壁酶液能有效地破坏烟草细胞壁，提高叶绿
体的产量，进而提高了
cpDNA
产量，但对其他植
物细胞作用的情况还不清楚。我们选择通常被认为
细胞壁较难破坏的单子叶植物小麦和双子叶植物
大豆作为实验材料，用酶法制备其叶片的
cpDNA
，
结果见图
3
，从图中可以看出，采用酶法制备，
4 g
小麦和大豆新鲜叶片也能制备出满足实验要求的
cpDNA
样品。
图
2
烟草
cpDNA
Sam
Ⅰ酶切结果
注
: M:
Hin
d
Ⅲ
marker; 1:
Sam
Ⅰ酶切结果。
Figure 2
Nicotiana tabacum
chloroplast DNA digested with
Sam
Ⅰ
Note: M:
Hin
d
Ⅲ
marker; 1: Results of tobacoo cpDNA
digested with
Sam
Ⅰ