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郑丽玲等
, 2011,
棉花硝酸盐高亲和
转运蛋白基因
NRT2
片段克隆及
RNA
干扰表达载体构建
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.102 pp.1735-1740 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0102)
1738
表
1
干扰载体正向与反向重复序列的引物序列
Table 1 Interference plasmid with the forward and reverse primers Sequence
引物名称
引物序列
酶切位点
Primer name
Primers
Restriction sites
Fw1
CGAGCTCCTGGGATGACAGGAGGAGGT
Sac
Ⅰ
Fw2
CCCATGGGTGCCGATGGAGTAGCATTAGAG
Nco
Ⅰ
Fv1
GCTCTAGACTGGGATGACAGGAGGAGGT
Xba
Ⅰ
Fv2
CCCTCGAGTGCCGATGGAGTAGCATTAGAG
Xho
Ⅱ
注
: Fw2
和
Fv2
分别表示下游引物
; Fw1
和
Fv1
分别表示上游引物
; Fw1
和
Fw2
用于棉花硝酸盐高亲和转运蛋基因正向目的
片段扩增
; Fv1
和
Fv2
用于棉花硝酸盐高亲和转运蛋基因反向目的片段扩增
Note: Fw2 and Fv2 stand for reverse prime; Fw1 and Fv1 stand for forward primer; Fw1 and Fw2 high affinity for cotton nitrate
transporter gene and amplification of the forward fragment; Fv1 and Fv2 high affinity for cotton nitrate transporter protein gene
fragment amplified by the reverse
家族成员多具有器官和组织的特异性，有些基因的
表达还受到植物生长和发育状况的影响，植物中的
很多
NO
2
-
转运蛋白基因优先在根部表达。杜培粉等
(2009)
如烟草和拟南芥，其中烟草的叶片，叶柄，
芽，花及种子中只检测到了微量的
NRT
2
基因的表
达，拟南芥的
NRT
2
基因在茎中的表达量仅为根部
的
1%
。高亲和氮高效基因
NRT
家族不仅具有运输
NO
3
-
，而且具有运输氨基酸，氯酸盐的作用。此外
NRT
家族成员还参与作物生长，发育的调节。
选择合适当的片段是
RNAi
载体构建关键因
素。魏海燕等
(2008)
研究表明，基因片段大小在
23~1 kb
都能得到理想的干扰效果。
Wesley
等
(2001)
还有研究表明，干扰片段的长度对基因干涉效有影
响，干扰片段在
50~500 bp
之间，随着片段大小的
增加，干扰效率提高。陈新等
(2007)
基因片段太短
构建操作困难，而且过短的
dsRNA
很难被
DICER
酶识别；过长的基因片段在构建载体操作中很容易
引起片段重组，并且太长的
dsRNA
结构本身不稳
定。因此，最佳基因片段大小应该在
200~600 bp
左
右，利于转化验证和外源基因在转基因植株中的稳
定遗传。所以，本研究设计选取
350 bp
的干扰片段，
目的是有效抑制靶标基因的表达。
本研究构建了硝酸盐高亲和转运蛋基因的
RNA
干扰载体，以正向和反向重复序列插入到中间载体
pUCM-T
的内含子两端，利用
pPZP35S
作为桥梁载
体，成功构建
RNA
干涉表达载体
pPZP35S-NAR
2
B
。
下一步工作将通过农杆菌介导法将植物表达载体
pPZP35S-NAR
2
B
转入到烟草中，利用
RT-PCR
快速
检测其对硝酸盐高亲和转运蛋基因的的干扰效果，
如得到较好的干扰效果将进一步探索在棉花植株
上诱导
RNAi
的条件。
3
材料与方法
3.1
实验材料
3.1.1
植物材料
新陆早
12
号
(
由石河子大学农学院育种教研室
提供
)
采用水培
(
霍格兰营养液
)
方法，待棉花幼苗长
至三叶一心时进行低氮
(0.2 mmol/L)
胁迫处理
4 h
后
取棉花根部，液氮速冻后于-
80
℃保存。
3.1.2
菌株和载体
大肠杆菌菌株
(
Escherichia coli
) DH5α
，根瘤农
杆菌菌株
(
Agrobacterium tumefaciens
) GV3101
，含有
GUS
的内含子序列的中间载体
pUCM-T
由园艺系
实验室惠赠，植物表达载体
pPZP35S
由石河子大学
绿洲生态作物分子生物学实验室保存。
3.1.3
试剂
限制性内切酶
Sac
Ⅰ，
Nco
Ⅰ，
Xba
Ⅰ，
Xho
Ⅰ，
Taq
DNA
聚合酶，
T
4
DNA
连接酶购自
TaKaRa
公司，
胶回收试剂盒购自
Tiangen
公司，其他生化试剂均
为国产分析纯。
3.1.4
引物设计及合成
根据蓖麻和杨树的
NRT
2
基因保守序列，并通
过软件分析酶切位点，设计两对引物
(
表
1)
。
3.2
方法
3.2.1
目的片断的克隆及序列测定
用
CTAB
法提取棉花根部总
RNA
，用
TIAN-
Script cDNA
第一链合成试剂盒反转录成
cDNA
，以
反转录的
cDNA
为模板，分别用正反向目的片段的
引物，通过
RT-PCR
方法扩增得到棉花高亲和硝酸
盐转运蛋白基因的正向序列
NRT
2
w
和反向重复序列
NRT
2
v
的目的片段，反应程序：
94
℃预变性
4 min
；