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郑丽玲等
, 2011,
棉花硝酸盐高亲和
转运蛋白基因
NRT2
片段克隆及
RNA
干扰表达载体构建
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.102 pp.1735-1740 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0102)
1739
94
℃变性
1 min
；
54
℃退火
45 s
；
72
℃延伸
45 s
，
25
个循环；
72
℃延伸
10 min
。将获得的基因片段连接
pGEM-Teasy
载体并转化大肠杆菌
DH5α
。经菌液
PCR
鉴定和酶切鉴定正确后，挑取
2
个阳性克隆，
送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
3.2.2
棉花
NRT
2
基因
RNA
干扰载体的构建
用正向克隆的质粒
pGEM-NRT
2
w
和
pUCM-T
的质粒，进行
Sac
Ⅰ和
Nco
Ⅰ的双酶切至完全，电
泳后回收正向片段和开环的
pUCM-T
骨架，采用
T
4
DNA
连接酶将两者于
4
℃连接过夜，得到重组子
pUCM-NRT
2
A
，转化
DH5α
，
PCR
鉴定和酶切鉴定
筛选阳性克隆。
采用
Xba
Ⅰ和
Xho
Ⅰ分别对重组子
pUCM-NRT
2
A
和反向克隆的质粒
pGEM-NRT
2
v
进行完全双酶切，
电泳后回收
pUCM-NRT
2
A
和反向片段，采用
T
4
DNA
连接酶将两者于
4
℃连接过夜，得到重组子
pUCM-NRT
2
B
，转化
DH5α
，
PCR
鉴定和酶切鉴定
筛选阳性克隆，阳性克隆即为棉花
NRT
2
基因的
RNA
干扰载体。
3.2.3 RNAi
表达载体在农杆菌中的转化与鉴定
从鉴定无误的大肠杆菌中提取重组子的质粒，
将得到的重组质粒用
Sac
Ⅰ和
xba
Ⅰ双酶切，切下含
正向序列、反向重复序列和内含子间隔序列的目标
片段，并进行回收。再用
Sac
Ⅰ和
Xba
Ⅰ双酶切质
粒
pPZP35S
，回收大片段。将目标片段与回收的
pPZP35S
载体大片段用
T
4
DNA
连接酶在
4
℃下连接
过夜，转化筛选阳性克隆即得
RNA
干扰载体
pPZP-
35S-NRT2B
。利用电击法将重组质粒
pPZP35S-NRT
2
B
转化到农杆菌
GV3101
中，将菌液涂布于
TYE (20
μg/mL Rifa+50 μg/mL Kna)
固体培养基中，于
28
℃
条件下培养
2 d
，挑取单菌落进行
PCR
检测。
作者贡献
郑丽玲、张伟和张薇是本研究的主要执行人；郑丽玲，
张伟完成数据分析，论文初稿的写作；李艳军，马玲玲和魏
延宏参与实验设计，试验结果分析；张薇是项目的构思者及
负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体
作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由石河子大学科学技术研究发展计划“动植物育
种专项计划项目”转基因专项子专
(2008ZX08005
-
005)
资助。
作者感谢石河子大学李艳军老师在本实验过程中的技术支
持和有益的建议。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和
修改建议。本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商
和测序服务商，这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商
的产品和服务提供推荐或背书。
参考文献
Abbott D.C., Wang M.B., and Waterhouse P.M., 2000, A single
copy of a virus-derived transgene-encoding hairp in RNA
gives immunity to barley yellow dwarf virus, Molecular
Plant Pathology, 1(6): 347-356
Chen X., Liu Q.Z., Li Y.X., Lv H.Z., Liang Y.Q., Zhang S.G.,
Shao J.P., and Zhang Y.H., 2007, RNAi expression vector
construction of α
-
farnesene synthase gene from Yali Pear
(
Pyrus breschneideri
Rehd), Shengwu Jishu Tongxun (Lett
Biotechnologe), 18(5): 786-788 (
陈新
,
刘庆忠
,
李杨昕
,
吕慧贞
,
梁雅芹
,
张士刚
,
邵建萍
,
张元湖
, 2007,
鸭梨
一法尼烯合成酶基因双链
RNAi
表达载体的构建
,
生物
技术通讯
, 18(5): 786-788)
Du P.F., Wu L.T., Yao Y.T., Yi F., Ruan Y., and Liu C.L., 2009,
Construction of the RNAi Vector of
AtTPS03
gene and
Arbidopsis Transformation
, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular
Plant Breeding), 7(3): 451-455 (
杜培粉
,
伍林涛
,
姚远颋
,
尹峰
,
阮颖
,
刘春林
, 2009,
AtTPS03
基因
RNA
干扰载体
的构建及拟南芥转化
,
分子植物育种
, 7(3): 451-455)
Hirotaka K., Eri K., Robert W.R., and Hiroshi K., 2006, RNAi
knock-down of
ENOD40s
leads to significant suppression
of nodule formation in Lotus
japonicus
, Plant Cell
Physiol., 47(8): 1102-1111
Li J.R., Zhao W., Li Q.Z., Ye X.G., An B.Y., Li X., and Zhang
X.S., 2005, RNA silencing of
Waxy
gene results in low
leve is of Aamylose in the seeds of Trans genic wheat
(
Triticumaes tivum
L.), Yichuan Xuebao (Genetics), 32(8):
846-854 (
李加瑞
,
赵伟
,
李全梓
,
叶兴国
,
安宝燕
,
李
祥
,
张宪省
, 2005,
Waxy
基因的
RNA
沉默使转基因小麦
种子中直链淀粉含量下降
,
遗传学报
, 32(8): 846-854)
Lv D.Q, Tong Y.A., and Sun B.H., 1998, Study on effect of
nitrogen fertilizer use on environment pollution, Zhiwu
Yingyang Yu Feiliao Xuebao (Plant Nutrition and Fertilizer
Science), 4(1): 8-15 (
吕殿青
,
同延安
,
孙本华
, 1998,
氮
肥施用对环境污染影响的研究
,
植物营养与肥料学报
,
4(1): 8-15)
Napoli C., Lemieux C., and Jorgensen R., 1990, Introduction of
a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in
reversible co-suppression of homologous genes in trans,
Plant Cell, 2(4): 279-289
Pinto Y.M., Kok R.A., and Bandcombe D.C., 1999, Resistance
to rice yellow mottle virus (RYMV) in cultivated African
rice varieties containing RYMV transgenes, Nature
Biotechnology, 17(7): 702-707