Basic HTML Version
郑丽玲等
, 2011,
棉花硝酸盐高亲和
转运蛋白基因
NRT2
片段克隆及
RNA
干扰表达载体构建
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.102 pp.1735-1740 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0102)
1737
图
3 RNAi
载体
pUCM-NRT
2
B
构建中的酶切和
PCR
鉴定
注
: M: DL2000 A marker; A: 1: pUCM-NRT
2
A
的
PCR; 2, 3:
pUCM-NRT
2
B
的
PCR; B: 1, 2:
Sac
Ⅰ和
Nco
Ⅰ双酶切
pUCM-
T; C: 1:
Sac
Ⅰ和
Nco
Ⅰ双酶切
pGEM-NRT
2
w; 2:
Xba
Ⅰ和
Xho
Ⅰ双酶切
pGEM-NRT
2
v; 3: pUCM-NRT2A
的酶切
; 4: pUCM-
NRT
2
B
的酶切
; D: 1, 2:
干扰载体
pUCM-NRT
2
B
的酶切
Figure 3 RNAi plasmid pUCM-NRT
2
B digestion and PCR
identification in the built
Note: M: DL2000 Amarker; A: 1: pUCM-NRT
2
A of PCR; 2, 3:
pUCM-NRT
2
B of PCR; B: 1, 2:
Sac
Ⅰ
and
Nco
Ⅰ
double
digestion pUCM-T; C: 1:
Sac
Ⅰ
and
Nco
Ⅰ
double digestion
pGEM-NRT
2
w; 2:
Xba
Ⅰ
and
Xho
Ⅰ
double digestion pGEM-
NRT
2
v; 3: pUCM-NRT
2
A of digestion; 4: pUCM-NRT
2
B of
digestion; D: 1, 2: interference plasmid pUCM-NRT
2
B of
digestion
转化
DH5α
，进行
PCR
和酶切检测，分别得到
350 bp
和
1 200 bp
左右的条带
(
图
3A,
泳道
2
和泳道
3
所
示
;
图
3D,
泳道
1
和泳道
2
所示
)
，说明
pUCM-
NRT
2
B
干扰载体构建成功。
1.4 RNAi
表达载体构建及鉴定
将重组子
pUCM-NRT
2
B
和
pPZP35S
分别用
Sac
Ⅰ和
Xba
Ⅰ酶进行双酶切，分别回收
pPZP35S
大片
段和重组子
pUCM-NRT
2
B
的目的片段，将两者连
接，得到干扰表达载体
pPZP35S-NRT
2
B
。将构建好
的干扰载体通过电击法转入农杆菌
GV3101
中，对
转化菌落提取质粒并以
(
表
1)
中的引物进行
PCR
验
证，分别得到
350 bp
左右的片段
(
图
4)
。
PCR
检测
结果显示已成功构建了具有
pPZP35S-NRT
2
B
表达
框架的植物载体
(
图
5)
，构建的
RNAi
载体已进行了
烟草叶片转染，鉴定正在等待之中。
2
讨论
RNA
干扰是真核细胞本身固有的生理发展调
节机制和对抗外源基因及其侵害的一种自我保护
现象，在利用
RNA
干扰引发的基因沉默当中，效
率要比传统的反义
RNA
诱导的基因沉默高得多，并
且能够稳定表达，这使得
RNA
干扰技术成为抑制
图
4
转化农杆菌的
PCR
验证
注
: M: DL2000 marker; 1:
正向序列
NAR
2
w
的扩增结果
; 2:
反向重复序列
NAR
2
v
的扩增结果
Figure 4 Agrobacterium transformation of the PCR verification
Note: M: DL2000 marker; 1: Forward sequence results of
amplification NAR
2
w; 2: Reverse repeats sequence of amplification
NAR
2
v results
图
5 pPZP35S-NRT
2
B
表达框架结构示意图
注
: RB:
右边界
; 35spm: 35S
启动子
; sense:
正向片段
; GUS:
GUS
内含子
; Anti-sense:
反向片段
; OCS ter: OCS
终止子
;
NOS pro: NOS
启动子
; NPT
Ⅱ
:
新霉素磷酸转移酶基因
;
NOS ter: NOS
终止子
; LB:
左边界
Figure 5 pPZP35S-NRT
2
B expression framework diagram
Note: RB: Right border; 35S: 35S promoter; sense: Fragment in
sense orientation; GUS: GUS intron; Anti-sense: Fragment in
anti-sense orientation; OCS ter: OCS terminator; NOS pro: NOS
promoter; NPT
Ⅱ
: Neomycin phosphotransferase gene; NOS
ter: NOS terminator; LB: Left border
基因表达的高效可靠的技术。近年来，朱见明等
(2011) RNAi
技术广泛应用于基因功能的分析验证，
构建合适的载体是
RNAi
的关键，本研究所构建的
RNA
干扰表达载体是含
GUS
内含子的一种发夹结
构，具有较高的干扰效率，是目前研究的热点。
Napoli
等
(1990)
利用
RNA
干扰技术证证明了
RNAi
对大豆子叶中
IFS
基因的功能作用。李小平等采用
RNA
干扰技术证明了大豆叶片衰老与大豆
LRP
型
类受体蛋白激酶基因
rlpk2
有关。
Hirotaka
等
(2006)
利用
RNA
干扰技术表明了豆科植物根瘤素合成基
因
ENOD40
对根瘤的出现和生长是必需的。
徐海荣等
(2007) NO
3
-
转运蛋白基因已在水稻，
小麦，蓖麻，杨树等植物中获得克隆，但在棉花中
还没报道，在植物体内的表达具有组织特异性，
NRT
2