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郑丽玲等
, 2011,
棉花硝酸盐高亲和
转运蛋白基因
NRT2
片段克隆及
RNA
干扰表达载体构建
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.102 pp.1735-1740 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0102)
1736
将硝态氮和铵态氮由体外转入体内是氮素代谢的第
一步，它不仅受外界环境的影响，同时也受植物自
身内在因素的影响。研究表明，作物根系对土壤中
NO
3
-
和
NH
4
+
的吸收和它们在植株器官、组织中的转
运是由位于细胞原生质膜氮素转运蛋白介导来完成
的。植物中氮素转运蛋白在改善植物氮胁迫条件下
的氮素吸收和利用效率具有重要作用。因此，利用
基因工程克隆棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因，并
通过转基因技术培育棉花氮高效品种，对减少氮的
浪费，提高氮的利用率具有十分重要的意义。
李加瑞等
(2005) RNAi
是指小的双链
RNA
(double-strandedds RNA)
阻碍生物体内特定基因表
达，使
mRNA
降解，使特定基因失活细胞表现出
缺陷表型的过程。自
RNA
干扰
(RNA interference,
RNAi)
技术诞生以来，该技术得到迅速发展，为作
物品质改良提供了新技术，已在
Pinto
等
(1999)
水
稻、
Abbott
等
(2000)
小麦，
Subramanian
等
(2005)
大
豆等多种作物的品质，抗逆改良中得到成功应用。
NRT
2
基因在水稻等作物中得到较好的利用，而
对于棉花至今还没有相关的研究报道，利用分子生物
学方法克隆棉花硝酸盐高亲和转运蛋白基因片断，以
此为靶基因构建了棉花
NRT
2
基因的
RNA
干扰表达
载体，为进一步研究该基因的功能奠定一定的基础。
1
结果与分析
1.1
棉花总
RNA
的提取
用
CTAB
法，提取低氮胁迫处理的棉花根部的
总
RNA
。经分光光度计测定
OD
260
/
OD
280
=1.80~2.00
，
OD
260
/
OD
280
=2.00~2.35
，琼脂糖凝胶电泳检测显示，
28S rRNA
的亮度约为
18S rRNA
的两倍
(
图
1)
，说
明
mRNA
质量良好，符合实验所需。
图
1
棉花根部总
RNA
琼脂糖凝胶电泳
注
: 1, 2:
棉花根部总
RNA
Figure 1 Cotton root total RNA agarose gel electrophoresis
Note: 1, 2: Roots of cotton total RNA
1.2
正反向目的片段的克隆与鉴定
将提取的总
RNA
反转录成
cDNA
，分别用正
反向引物扩增目的片段，扩增产物经凝胶电泳检
测，与预期一致，获得长约
350 bp
的两条
DNA
片
段
(
图
2)
。将正反向片段分别克隆到
pGEM-T
载体
上，各挑取
PCR
鉴定正确的两个阳性克隆进行测
序，测序得到正反向序列大小均为
350 bp
，经
DNAman
比对与蓖麻的同源性为
80%
，与杨树的同
源性为
79%
。
图
2
NRT
2
正向序列
NRT
2
w
与反向重复序列
NRT
2
v
的扩增
产物
注
: M: DL2000 marker; 1, 2:
正向序列
NRT
2
w
的扩增产物
; 3,
4:
反向重复序列
NRT
2
v
的扩增产物
Figure 2
NRT
2
forward and reverse repeat sequences NRT
2
w
and NRT
2
v of amplification products and sequences (Here is
the sequence obtained from fragments)
Note: M: DL2000 marker; 1, 2: Forward sequence of the PCR
products NRT
2
w; 3, 4: Inverted repeats NRT
2
v the PCR products
1.3
中间载体的构建
将正向克隆的质粒
pGEM-NRT
2
w
经
Sac
Ⅰ和
Nco
Ⅰ完全双酶切后，获得约
350 bp
的条带
(
图
3C,
泳道
1
所示
)
，回收该片段。
pUCM-T
质粒经
Sac
Ⅰ
和
Nco
Ⅰ双酶切后，得到开环的载体骨架
(
图
3B,
泳
道
1
和泳道
2
所示
)
，大小约为
2 773 bp
，将其回收。
正向片段
NRT
2
w
与开环骨架
pUCM-T
连接得到重
组子
pUCM-NRT
2
A
，将其转化
DH5α
，进行
PCR
和酶切检测，得到
350 bp
的条带
(
图
3A,
泳道
1
所
示
;
图
3C,
泳道
3
所示
)
，进一步经测序进行确认，
说明正义片段已经按正确方向插入到启动子与间
隔区之间，形成了中间载体
pUCM-NRT
2
A
。
采用
Xba
Ⅰ和
Xho
Ⅰ分别对
NRT
2
v
的质粒和
重组子
pUCM-NRT
2
A
进行双酶切，前者产生了约
350 bp
目的片段
(
图
3C,
泳道
2
所示
)
，后者产生了
约
3 100 bp
的开环骨架
(
图
3C,
泳道
4
所示
)
，分别
将两者回收，连接重组，得到干扰载体
pUCM-NRT
2
B
，