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饶龙兵
, 2011,
冷杉基因组
DNA
遗传标记芯片的构建与分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.101 pp.1726-1734 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0101)
1728
到的有效标记数也不同。要得到高质量的基因组
DNA
芯片和得到符合一定质量参数的有效标记
数，就需要研究合适
DNA
提取方法、合适的酶切
和引物组合试验，笔者根据此思路开展了基因组
DNA
提取、多种不同酶切组合和不同引物扩增实
验，成功制作了用于冷杉遗传多样性检测的芯片，
并做初步应用分析。
1
结果与分析
1.1
冷杉基因组
DNA
提取
利用改良的
CTAB
法从冷杉叶片中提取冷杉基
因组
DNA
，经检测样品
D
260 nm
和
D
280 nm
光度值，
其比值都在
1.9
左右；风干后
DNA
溶液清亮，无黏
稠感，实验结果说明提取的
DNA
纯度较好，样品
中基本无多糖、蛋白质、和酚类等杂质。
将提取的冷杉叶片
DNA
与生物芯片
DNA
工作
缓冲液混合，室温静置
3 h
，利用琼脂糖凝胶电泳
检测分析。如果
DNA
提取质量不好，或不适合
DNA
芯片工作缓冲液环境，则凝胶电泳后
DNA
可能检
测不出或裂解。本实验检测结果如图
1
所示。由图
可以看出，电泳样品孔均不发亮，各泳道
DNA
主
带清晰，基本无弥散带，说明提取的
DNA
完整性
较好，纯度也较高。电泳图谱显示有少许
RNA
存
在，但
RNA
在本实验系统中不影响实验结果。
图
1
冷杉基因组
DNA
电泳检测图
注
: M: GeneRuler 1 kb DNA ladder marker; 1~16: 16
个冷杉
样品
Figure 1 The electrophoresis pictures of genomic DNA
Note: M: GeneRuler 1 kb DNA ladder marker; 1~16: Sixteen
different fir samples
1.2
冷杉基因组
DNA
不同组合酶切和不同引物扩增
效果
采用
7
种不同的限制性内切酶组合酶切冷杉基
因组
DNA
后，用无选择性碱基
Pst
Ⅰ引物扩增，扩
增电泳图如图
2
，用添加选择性碱基
CAG
的
Pst
Ⅰ
引物扩增图如图
3
。从图
2
中可看出，酶切组合
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ
+
Mse
Ⅰ
(
图
2C,
泳道
17~24)
酶切片段大
小分布在
750 bp
左右，而且分布比较均匀集中，分
子量比较大的片段和比较小的片段相对较少。从该
酶切组合的
Pst
Ⅰ引物添加选择性碱基
CAG
扩增图
3
分析，所在泳道
13
、泳道
14
没有明显的条带，
说明该酶切组合能较均匀切开冷杉基因组
DNA
。综
合图
2
和图
3
分析认为
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ
+
Mse
Ⅰ酶切组
合效果最好。
Pst
Ⅰ
+
Bst
N
Ⅰ、
Pst
Ⅰ
+
Taq
Ⅰ的酶切效
果次之，其它几种酶切组合不甚理想，表现为片段
过大或均匀度差，出现明显条带。
1.3
冷杉芯片文库盘质量分析
基因组
DNA
经过酶切扩增后采用
TOPO
载体
克隆，多个克隆构成芯片文库。在文库构建克隆挑
选过程中，理论应该在文库盘每格
(
孔
)
位置上有一
个克隆点，实际操作过程中有可能漏放或重放或挑
选了空克隆，这样可能会影响芯片质量。为了保证
文库盘质量，挑选的克隆点需要先检测，一般文库
盘中错误克隆点必须要小于
5%
，最好控制在
2%
以
内水平。本实验文库盘克隆点检测部分电泳图样如
图
4
示，从左致右
1~33
泳道，第
1~16
泳道为
16
个
克隆点，第
17
泳道为间隔，第
18~33
为另外
16
个
克隆点。从此电泳图可看出，挑选出的克隆片段大
小主要约在
500~1 000 bp
左右，少数克隆在
1 000~
1 500 bp
，而且每检测孔道均有
1
个克隆，满足芯
片文库盘的质量要求。
1.4
冷杉芯片质量分析
当芯片文库盘作好后，就可以将文库盘上克隆
点点样于芯片上，制作成遗传标记检测芯片。芯片
上样点的均匀程度是衡量芯片质量的重要指标。制
作出一批芯片后，将采用部分样品和芯片杂交，通
过杂交信号及参数可以判断芯片质量。
从表
1
可知，各张芯片的样点基本比率、中值、
均值比率相关系数为
0.866~0.976
，说明样点点样及
杂交后的均匀性很好，质量可靠。信噪比是判断检
测系统性能和芯片杂交稳定性的重要参数，理想检
测仪器的信噪比都在一定范围。从表
1
中可看出参
考通道信噪比为
79.017~92.024
，杂交后检测通道信
噪比为
20.786~32.827
，符合检测系统的理想信噪比
值。综合样点的
3
种比率相关系数及信噪比参数可
以判断，采用该方法得到的芯片质量比较好，可以
用于有关冷杉检测分析工作。
1.5
有效标记得率分析
本试验测试中共随机挑选有效克隆
4 608
个点
样制作遗传标记检测芯片，经
8
样品杂交检测数据