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饶龙兵
, 2011,
冷杉基因组
DNA
遗传标记芯片的构建与分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.101 pp.1726-1734 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0101)
1727
有一定局限性。如
RFLP
技术需要利用放射性同位
素，实验成本较高；
RAPD
技术稳定性不太理想；
SSR
技术开发需要一定的
DNA
序列背景信息，引
物开发难度大；
ISSR
由于是随机引物筛选，费事费
力；
AFLP
由于得到的是酶切混合片段，不能将不
同来源的相同长度大小
DNA
片段分开，技术相对
比较粗放等。这些技术离理想的遗传标记技术还有
一段差距，而且这些技术都基于毛细管电泳或凝胶
电泳技术，整个检测过程自动化程度低，通量低，
产出率低，精度低。
基因芯片技术是近年发展起来的一项新的生
物技术
(
陈忠斌等
, 2005)
。芯片技术是将得到的探针
DNA
用芯片点样仪点于芯片载体上，然后将待检样
品和芯片杂交，最后利用检测仪判断杂交信号大
小。芯片样品点直径通常在
25~500 μm
，通常
1 cm
2
可点样
2 500
个点阵，一般
1
张载玻片可容纳
30 000
左右
DNA
探针，芯片技术具有明显的高通量的特
点，而且芯片技术是基于分子杂交的检测技术，与
常规凝胶电泳技术相比具有高精度的特点，另外检
测样品需求微量化。基因芯片技术已经在生命科学
的许多领域得到广泛应用，如在医药、动植物疾病
诊断、遗传代谢分析、食品安全检测和侦测等方面
都有应用
(
陈忠斌等
, 2005)
。目前制作的基因芯片绝
大部分属表达谱芯片，芯片点样的
DNA
主要是
cDNA
或合人工成的
DNA
，芯片检测的目的主要集
中在新基因发现、基因功能研究、基因诊断、
DNA
序列分析、
SNP
检测等研究方面
(
梁秀彬等
, 2002)
。
如果能将芯片技术的自动化、高通量、高精度特点
和遗传标记技术结合起来，将基因组
DNA
制作成
遗传标记的检测芯片，用于遗传分类、进化、遗传
作图、辅助育种和遗传多样性检测等方面，必将极
大促进遗传标记技术的发展。但基因芯片技术与遗
传标记技术如何结合，如何应用，应用效果如何等
问题，目前国内外在此方面应用研究报道较少，仅
限于位于澳大利亚的
Diversity Arrays Technology
(DArT)
技术实验室开展相关研究
(Jaccoud et al.,
2001; Wenzl et al., 2004; Xia et al., 2005; Wittenberg
et al., 2005; Akbari et al., 2006; Yang et al., 2006)
。
分布在我国南方的
5
种冷杉植物百山祖冷杉
(
A.
besganzuensis
) (
吴鸣翔定名发表
)
、元宝山冷杉
(
A.
yuanpaoshanensis
) (
吕庸浚和傅立国定名发表
)
、资
源冷杉
(
A. ziyuanensis
) (
傅立国和莫新礼定名发表
)
、
梵净山冷杉
(
A. fanjinshanensis
) (
黄威廉定名发表
)
和
大院冷杉
(
A. dayuanensis
) (
刘起衔定名发表
)
均为我
国的一级重点保护植物
(
《国家重点保护野生植物名
录》
)
和濒危植物
(
《中国植物红皮书》
)
，其中百山
祖冷杉目前野生植株仅剩
3
棵，被世界保护联盟维
护物种生存委员会
(SSCT)
列为世界最濒危的
12
种
植物之一。这
5
种冷杉植物的发现否定了以往亚热
带的低、中山无冷杉分布的观点，被认为是植物地
理学和植物学上的一大发现。由于冷杉属植物的分
布受第四纪冰川时期的影响，因此上述冷杉植物是
研究我国第四纪冰川时期植物区系和气候变迁的
“活化石”，对研究古气候、古地理和植物区系具
有重要意义。目前这
5
种冷杉分类存在争议，现有
分类的种内和种间遗传分化、遗传多样性不明，群
体保护地位重要性不清。要开展有关研究，必须采
用分子标记技术分析多态位点。多态位点数量具有
重要作用，位点少，信息可靠性低，位点多可靠性
高。多态位点的获得和检测样本大小及检测技术有
关。在有关冷杉研究中遇到特别是百山祖冷杉，现
有植株太少，满足不了一般群体取样样本数，常规
凝胶电泳技术位点检测能力低，通量低，基于目前
状况作者拟建立遗传标记芯片体系用于冷杉保护
遗传学研究。
该技术原理和基本步骤为：首先提取高质量的
基因组
DNA
，然后将基因组
DNA
通过限制性内切
酶酶切，产生不同大小的酶切片段，接着将酶切片
段通过添加选择性碱基引物扩增，降低酶切片段总
数量，再将这些选择性扩增后的酶切片段通过
TOPO
载体克隆，很多个克隆点构成一个芯片文库。
此部分操作为芯片文库构建，不同的材料采用不同
的酶切和引物扩增方法可以得到不同的芯片文库。
克隆产物通过培养，
PCR
扩增，扩增后的
DNA
再
经过纯化，最后将该纯化的克隆
DNA
点样在生物
芯片上，制成一张用于遗传标记检测的基因组
DNA
芯片。当要利用该芯片对待测样品检测时，先将被
检材料酶切，酶切后的
PCR
扩增物采用荧光标记，
然后将标记物和芯片杂交，最后通过杂交信号检测
判断检测样品与标记点同源性差异，杂交信号强，
则同源性高，否则就低。
由于不同材料的基因组
DNA
复杂性不同，以
及限制性酶切位点也存在很大差异，因此用不同
的限制性酶切，以及采用不同添加选择性碱基引
物扩增时产生的
DNA
片段大小、数量、以及片段
在基因组上分布位置的均匀性都有差异，最后得