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张玉喜等
, 2011,
牡丹花芽休眠解除过程中实时定量
PCR
内参基因的选择
,
分子植物育种
Vol.9 No.7 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0007)
1054
温和外源
ABA
产生反应。牡丹花芽属典型的内休
眠，需要有效低温为
0
-
10
℃的长时间的处理才能解
除休眠萌动开花展叶。本实验取
5
个时间的低温处
理的牡丹花芽，分别以
β-actin
和
b-tubulin
为内参基
因来分析脱水素基因的表达水平，结果如图
4
。以
两组引物做为内参基因的引物分析脱水素基因的
表达水平，其变化趋势高度相似，脱水素基因在
0 d
低温处理时表达水平最高，在低温处理
5
天后表达
量急剧下降，随着低温处理时间的延长，在休眠解
除前期呈上调表达趋势。当低温处理时间为
20
天
时，即休眠完全解除后，表达水平又急剧下降。
图
4
牡丹脱水素基因的表达水平分析
注
: A:
以
β-actin
为内参基因
; B:
以
b-tubulin
为内参基因
Figure 4 Expression analysis of dehydrin gene in tree peony
Note: A: Using β-actin as control gene; B: Using b-tubulin as
control gene
2
讨论
一个理想的内参应该在各种不同的细胞类型、
不同发育阶段、采用不同处理方法时都能稳定表
达，而内参的稳定表达正是确定目标基因在某一生
理发育时期相对表达水平的前提和基础。
β-actin
在
维持细胞形态、促进细胞运动和收缩等细胞生理活
动方面发挥着重要的作用
(Thellin et al., 1999;
Ohdan et al., 2005)
。本研究中选用了牡丹
cDNA
文库
中的
4
个看家基因
β-actin
、
b-tubulin
、
α-tubulin
和
60S-L
11
作为候选内参，其中
b-tubulin
，
α-tubulin
和
β-actin
为常用的看家基因。结果表明，肌动蛋白基
因
β-actin
表达相对稳定，这与
Reid
等人报道，肌动
蛋白基因是葡萄浆果发育过程中最稳定的内对照
基因之一的结论一致，而涂礼莉等
(2007)
在棉花纤
维发育过程中实时定量
PCR
内对照基因的筛选的研
究中发现肌动蛋白基因在非纤维系列表达水平是
最不稳定的。另外微管蛋白不同家族成员间的差异
较大，
b-tubulin
比
α-tubulin
稳定性大，而
Brunner
等
(2004)
在杨树的不同发育时期分析了
10
个传统的内
参基因，结果表明
α-tubulin
在不同的样品间变异系
数最小，表达最为稳定；
Jian
等
(2008)
在大豆中也发
现
α-tubulin
在大豆的不同发育时期的样品中稳定性
最好。本研究首次采用
60S
核糖体蛋白质
L
11
作为候
选基因，结果表明
60S-L
11
在
4
个候选内参基因中表达
水平较
α-tubulin
稳定，这在以往的文献中未见有相关
报道。
GeNorm
程序是专门用于分析内参基因稳定性
的程序，本文运用
GeNorm
程序计算所选的
4
个内参
基因稳定度的平均值
M
结果发现在对照的牡丹花芽
中即刚刚进入休眠的牡丹花芽中都有表达，当经历
不同的低温时间处理后表达的稳定性表现出一定的
差异，最终筛选到两个相对稳定的持家基因
(β-actin
和
b-tubulin)
作为内参。选择两个或两个以上的内参
基因作参照有助于得到更可靠的表达结果，这在大
豆
(Gutierrez et al., 2008)
、马铃薯
(Expsito-Rodrguez
et al., 2008)
、葡萄
(Reid et al., 2006)
和杨树
(Gutierrez
et al., 2008)
中已有过相关报道。
牡丹具有深休眠的特性，适量的低温是打破花
芽休眠的有效途径
(Aoki N, 1992a; 1992b)
。有效的
低温积累量在牡丹花芽内休眠的解除过程中起质
的作用。低温作为一种环境信号因子，能够诱导许
多相关抗性基因的表达。在北方秋末
(10
月下旬
)
利
用自然低温
(0
-
10
℃
) 30
-
50 d
可解除花芽休眠。本研
究采用人工控温
(10
℃
)
处理，设了五组处理，低温
处理
15
天时，牡丹花芽少数已经基本可以萌动，低
温处理
20
天牡丹花芽多数萌动。牡丹花芽内休眠的
解除是个复杂的生理过程，是多基因共同作用的结
果，脱水素基因就是其中的一种
(Xin Huang et al.,
2008)
。脱水素
(dehydrin,
DHN
)
是一种广泛存在于高
等植物的干旱诱导蛋白，对低温和外源
ABA
产生反
应，或在干旱、盐及胞外结冰的脱水胁迫植株中积
累。本实验结果表明，利用筛选出的两个候选基因
作为内参，
PsDHN
的表达趋势高度相同，即
PsDHN
在花芽进入内休眠期后的休眠解除前期呈上调趋
势，与刚刚进入休眠的
T
0
阶段相比表达水平有所降