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张玉喜等
, 2011,
牡丹花芽休眠解除过程中实时定量
PCR
内参基因的选择
,
分子植物育种
Vol.9 No.7 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0007)
1053
经过一定的低温积累量才能彻底解除休眠。
Xin
Huang
等
(2008)
利用
RT-PCR
方法，以转录延伸因子
基因
EF
作为内参基因，研究了牡丹内休眠解除过程
中相关基因的相对表达差异。目前国内尚无牡丹基
因表达分析中有关内参基因的选择的相关报道。本
研究从本实验室自建牡丹
cDNA
文库中选择
β-actin
，
b-tubulin
，
α-tubulin
和
60S-L
11
4
个管家基因，通过实
时定量
PCR
技术分析其在牡丹内休眠解除过程的表
达水平，利用
GeNorm
程序分许其表达稳定度。并
且利用所筛选出的内参基因，对牡丹的脱水素基因
(psDHN)
基因在花芽休眠解除前后进行了表达分析
研究，旨在选择一个或几个适合牡丹花芽内休眠解
除过程的内参基因，这对于研究牡丹特定基因的表
达水平，揭示牡丹花芽内休眠机理具有重要的理论
意义和实践价值。
1
结果与分析
1.1
内参基因的表达稳定性分析和最适数目的选择
在定量
PCR
分析中，针对特定的生理过程和样
品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准
确的基因表达结果至关重要。本研究选择了
b-tubulin
，
60S-L
11
，
α-tubulin
和
β-actin 4
个候选的内参基因，以
牡丹花芽
T
0
(
已经进入休眠状态
)
的
cDNA
为模板，
均扩增出了特异条带
(
图
1)
，说明
4
个候选的内参基
因在牡丹花芽
T
0
中均有表达。同时进行了实时定量
PCR
，
4
个内参基因的平均值
M
均小于
1.5
，因此用
GeNorm
程序分析内参基因表达的稳定性并进一步
排序，得到基因的表达稳定性依次为
0.477
、
0.486
、
0.519
和
0.438 (
图
2)
，即四者的稳定性由高到低依次
为为
β-actin>b-tubulin>60S-L
11
>α-tubulin
。
GeNorm
程序默认的
V
值为
0.15
，如果
V
n/n+1
大于
0.15
，则有
必要引入第
n+1
个基冈，反之，则不必引入新的内
参基因。本实验中
V
2/3
=0.113<0.15
，因此可以使用
表达相对稳定的
β-actin
和
b-tubulin
作为牡丹实时定
量
PCR
中的内参基因
(
图
3)
。
1.2
牡丹脱水素基因表达的实时定量
PCR
分析
脱水素基因属于
L EA
蛋白
(
胚胎发育晚期丰富
蛋白
)
家族，它是一种广泛存在于高等植物的干旱诱
导蛋白，在胚胎发生晚期产生，与植物耐脱水性密
切相关。脱水素起分子伴侣和亲水性溶质作用，在
水分胁迫时稳定和保持蛋白质的结构及功能，对低
图
1 4
个内参基因引物的
PCR
结果
注
: M: DL2000; 1: β-actin; 2: b-tubulin; 3: α-tubulin; 4:
60S-L
11
Figure 1 The PCR results of 4 control genes in the peony
flower bud
Note: M: DL2000; 1: β-actin; 2: b-tubulin; 3; α-tubulin; 4:
60S-L
11
图
2 4
个内参基因表达的稳定性差异
Figure 2 Comparison on stabilities of four control genes
图
3
内参基因的最适数目的判定
Figure 3 Determine of optimal number of four control genes