Basic HTML Version
张玉喜等
, 2011,
牡丹花芽休眠解除过程中实时定量
PCR
内参基因的选择
,
分子植物育种
Vol.9 No.7 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0007)
1055
低，这与前人的研究结果一致
(Yakovlev et al., 2008)
，
同时也说明本实验所筛选出的内参基因是合适的。
两对引物获得的结果高度一致，那么采用其中的一
对引物同样可以对目标基因在牡丹花芽内休眠解
除过程的表达数据进行标准化。
3
材料与方法
3.1
材料
牡丹品种引自山东菏泽牡丹基地
4
年生“鲁荷
红”，由青岛农业大学生命科学学院植物生理实验
室提供。
3.2
方法
3.2.1
牡丹材料处理
将
“
鲁荷红
”
起苗，单株栽植于盆内。根据
(Uath)
模型，打破休眠的有效低温为
0
-
10
℃，待日最低气
温达
10
℃时，此时低温处理
0
天，取花芽作为对照，
立刻取适量花芽投入液氮固定，于-
80
℃冰箱中保
存备用；另外，每隔
5
天选取一定数量的健壮植株
转移至
18
-
25
℃的温室中，并取样，一共
5
个不同低
温处理
(0 d, 5 d, 10 d, 15 d, 23 d)
，分别命名为
T
0
-T
4
，
基本包括了牡丹花芽进入休眠和休眠解除的整个
过程
(
郑国生等
, 2009)
。
3.2.2 RNA
提取和
cDNA
合成
根据
EASY spin
植物
RNA
快速提取试剂盒
(
原平
皓生物公司
,
天津
)
的操作说明，提取牡丹花芽总
RNA
，电泳检测
RNA
的完整性。用核酸蛋白分析仪
(BioRad,
美国
)
检测
RNA
的纯度和浓度。采用
SYBR
Primix DimerEraser
TM
RT reagent Kit
和
SYBR Premix
Ex Taq
TM
(TaKaRa,
大连
)
分别进行
cDNA
的合成和
qPCR
反应。
3.3
内参引物的设计和表达稳定性分析
根据本实验室建立的牡丹品种
“
凤丹
”
的
cDNA
文库中的
EST
序列分别设计
4
对内参基因，脱水素基
因的引物根据本实验室建立的牡丹品种“鲁荷红”
SSH
文库设计
(Xin Huang, et al., 2008)
，引物序列如
下表
1
。
10 µL
的反转录体系：
2 µL
的
5×Primer-Script
TM
Buffer
，
0.5 µL 50 µmol/L Oligo dT primer
，
0.5 µL
100 µmol/L random 6 mers
，
0.5 µL PrimerScript RT
enzyme mix
，
500 ng total RNA
，用
Rnase free H
2
O
补
足
10 µL
。反转录反应条件为：
37
℃
15 min
；
85
℃
5s
。
表
1
内参基因和脱水素基因的引物序列
Table 1 Primer sequences for control genes and dehydrin gene
引物名称
Primer
引物序列
primer Sequence
产物长度
Length of
products
60S-L
11
5'
-
ATCGGTCGGTGAAAGTGGAG
-
3'
5'
-
TACCAAAGCCAAAGCAGCCA
-
3'
253
b-tubulin 5'
-
TACAATGAGGCAAGTGGAGGG
-
3'
5'
-
GTGAATGGCAAACCTGAAACC
-
3'
264
α-tubulin 5'
-
AACCTACACGAACCTCAACCG
-
3'
5'
-
ATGGATGAAGGCTCAAACGCA
-
3'
236
β-actin
5'
-
GAGAGATTCCGTTGCCCTGA
-
3'
5'
-
CTCAGGAGGAGCAACCACC
-
3'
227
PsDHN
5'
-
GGAATAAGGGAGCGGTGGAC
AA
-
3
'
5'
-
CCAACGCCTGGAATCTTCTGC
T
-
3'
231
反转录
cDNA
产物用
EASY dilution 10
倍稀释作为实
时定量
PCR
分析的模板。
利用
Bio-Rad Chromo4 TM Real-Time PCR
仪进
行扩增。
PCR
反应体系为：
2×SYBR Premix Dimer
Eraser
TM
12.5 µL
，
10 µM
的上下游引物各
0.75 µL
，
cDNA
模板
2 µL
，无菌水补齐到
25 µL
。每个样品重
复
3
次。反应条件为：
95
℃
30s
；
95
℃
5s
、
57
℃
30s
、
72
℃
30s
，共
35
个循环。设置在延伸收集荧光信号。
经
Opticon Monitor3.0
程序分析可得到各内参在样
本的循环阈值
(C
t
值
)
，并用
GeNorm (Vandesompele et
al., 2002)
程序进行转换和分析。利用筛选到的内参
基因，采用相同的定量
PCR
反应体系和程序，进行
牡丹脱水素基因的表达水平分析。
3.4
数据处理和分析
实时定量
PCR
反应结束后，数据用
Excel 2003
软件初步处理，再采用
GeNorm
程序分析。在
Excel
中将不同样品中某一内参基因
C
t
值最小者对应样品
的表达量定义为
1
，其他样品此内参基因的相对表
达量为
2
-
△
Ct
，将这些数据导入
GeNorm
程序。在进行
数据转换后，计算基因表达稳定度
M
并进行排序
(M
值越小
,
表达越稳定
)
，最后根据内参基因标准化因
子的配对差异分析
(V
n/n+1
)
，判定内参基因的最适数