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Guo et al., 2011, Rapid Acquirement of Transgenic Rice Plants Derived
from Callus of Mature Embryos Transformed by Agrobacterium Mediation, Molecular Plant Breeding (online) Vol.2 No.2 (doi: 10.5376/mpb.2011.02.0002)
1034
彬等
, 1999)
，而谷氨酰胺
(Gln)
会抑制乙酰转移酶的
作用方式。所以，在筛选培养基中谷氨酰胺应当除
去。筛选阶段选择在绝大部分愈伤出现绿点后筛选。
3
材料与方法
3.1
植物及细菌培养基
实验所用材料台北
309
和日本晴均种植于贵州
大学转基因植物试验示范基地温室中。植物培养基
根据文献报道进行部分改动
(
林拥军等
, 2008;
向阳
等
, 2004;
余婧等
, 2008)
。改动为重悬液加入了
36
g/L
的葡萄糖，灭菌方式为：高温高压
121
℃，
15
分
钟
(
表
1)
。
表
1
培养基成分
Table 1 The composition of culture medium used in this study
培养基名称
The name of medium
培养基组分及含量
The composition of medium
愈伤组织
Callus induction
NB (N
6
macro+B
5
micro+B
5
vitamine)+CH; 300 mg/L+Pro; 500 mg/L+Gln; 500 mg/L+2,4
-
D; 2 mg/L
+sucrose; 30 g/L+Agar; 8 g/L, pH: 5.8
共培养
co-culture
NB+CH; 300 mg/L+Pro; 500 mg/L+Gln; 500 mg/L+2,4
-
D; 2 mg/L+AS; 100 umol/L+sucrose; 65 g/L+Agar;
8 g/L, pH: 5.2
脱菌
Sterilization
NB+CH; 300 mg/L+Pro; 500 mg/L+Gln; 500 mg/L+2,4
-
D; 2 mg/L+Timentin; 300 mg/L+sucrose; 30
g/L+Agar; 8 g/L, pH: 5.8
筛选
Selection
NB+6
-
BA; 2 mg/L+KT; 0.5 mg/L+NAA; 0.5 mg/L+Timentin; 300 mg/L+PPT; 4 mg/L+sucrose; 30
g/L+Agar; 8 g/L, pH: 5.8
分化
Differentiation
NB+CH; 300 mg/L+Pro; 500 mg/L+Gln; 500 mg/L+6
-
BA; 2 mg/L+KT; 0.5 mg/L+NAA; 0.5
mg/L+Timentin; 300 mg/L+sucrose; 30 g/L+Agar; 8g/L, pH: 5.8
生根
Rooting
1/2MS+ NAA; 0.5 mg/L+sucrose; 30 g/L+Cef; 150 mg/L+Agar; 8 g/L, pH: 5.8
重悬液
Resuspension liquid
NB+CH; 300 mg/L+Pro; 500 mg/L+Gln; 500 mg/L+2,4
-
D; 2 mg/L+AS; 100 umol/L+sucrose; 68.5
g/L+glucose; 36 g/L+Agar; 8 g/L, pH: 5.2
YEP
Peptone; 5 g/L+Yeast extract; 10 g/L+Nacl; 5 g/L+Km ;50 mg/L+Rif; 100 mg/L, pH: 7.2
3.2
农杆菌菌株、质粒
单子叶植物表达质粒
pCAMBIA0390
的
T-DNA
区含玉米泛素启动子
Ubi1
启动筛选报告融合基因
Bar::GUS
。水稻肌动蛋白启动子
Actin1
驱动的
Bt
功
能基因和终止子序列
nos
。
LF
分别为重组酶
Cre
和
Flp
的识别位点
loxp
和
frt
，该位点可被
FLP
识别，并将其
间的外源基因定点删除
(
赵德刚等
, 2008;
罗克明等
,
2005)
。其
T-DNA
区域见图
6
。
3.3
外植体的获得和愈伤组织诱导
实验采用台北
309
、日本晴成熟胚作为愈伤组织
诱导的外植体。将成熟种子去掉颍壳，除去色泽不
正常的种子，消毒处理方法为
75%
酒精消毒
1 min
，
0.1% HgCl
2
消毒
10 min
，之后单蒸水涮洗
5
至
6
次。
图
6
质粒
pCAMBIA0390
的
T-DNA
区结构
Figure 6 The T-DNARegion of plasmid pCAMBIA0390
外植体消毒后使用无菌单蒸水浸泡
8
-
12
小时，
然后切除胚乳，接种于愈伤诱导培养基上。浸泡时
单蒸水与外植体体积比约为
4
：
1 (
每次处理
50
个水
稻外植体
,
一共处理
250
个
,
除去污染愈伤组织
,
只
统计
200
个水稻外植体的愈伤诱导率
,
愈伤诱导率
(%)=
出愈胚数
/
接种幼胚数×
100%)
。
3.4
光照培养条件
28
℃暗培养，约
3
至
4
天长出芽，用解剖刀将芽
完全切去，再将成熟胚接至愈伤组织诱导培养基，
然后采用下面方式处理：
(1)28
℃、
21 d
的光照培养，
光照强度为
2000 lux
，
13 h/d
。
(2)28
℃、
21 d
的暗培
养
(
每次处理
50
个愈伤组织
,
一共处理
250
个
,
除去
污染愈伤组织
,
只统计
200
个愈伤组织的分化率
,
愈伤分化率
(%)=
长出芽的愈伤数
/
愈伤组织总数×
100%)
。
3.5
愈伤组织饥饿处理及侵染
在侵染开始前，将愈伤组织进行饥饿处理
(
鲁玉