Basic HTML Version
Guo et al., 2011, Rapid Acquirement of Transgenic Rice Plants Derived
from Callus of Mature Embryos Transformed by Agrobacterium Mediation, Molecular Plant Breeding (online) Vol.2 No.2 (doi: 10.5376/mpb.2011.02.0002)
1035
柱等
, 2008)
。将经过饥饿处理的愈伤组织置于农杆
菌菌液中
(OD
600
≈
0.4)
侵染
15 min
，侵染完后倒出愈
伤组织并用干燥无菌纸吸去多余菌液。
3.6
侵染后与共培养后干燥处理
侵染后对愈伤组织进行如下处理：
A
组：不经
过干燥处理，直接进行共培养，然后进行分化培养。
B
组：侵染后进行干燥处理。干燥处理方式为：在
超净工作台内，将愈伤组织置于吸水纸上风干
20
分
钟。共培养时在共培养基上垫一张滤纸，再将愈伤
组织置于滤纸上
(Hamid Rashid et al., 1996)
，
28
℃暗
培养
3 d
。共培养后使用甘露醇溶液冲洗
4
-
5
次至清
亮
(
甘露醇
0.1 mol/L,
内含头孢噻肟钠
Cef 300
mg/L)
。共培养后对愈伤组织进行如下处理：
C
组：
对侵染后未经干燥处理的愈伤组织进行干燥处理。
D
组：对侵染后经干燥处理的愈伤组织进行干燥处
理。干燥处理方式为：风干
20
分钟，再将愈伤组织
置于垫有
2
层吸水纸的培养皿中，光照条件下干燥
8
小时
(
每次处理
50
个愈伤组织
,
一共处理
250
个
,
除去
污染愈伤组织
,
只统计
200
个愈伤组织的分化率
,
愈伤分化率
(%)=
长出芽的愈伤数
/
愈伤组织总数×
100%)
。
3.7
愈伤组织分化及抗性植株的获得
将共培养后的愈伤组织接至分化培养基上进
行约
7 d
的分化。光照条件为
2 000 lux
、
13 h/d
，温
度
26
℃。然后进入约
14 d
的筛选分化，将获得的抗
性苗转移至生根培养基中。约
14 d
后，将根系发育
良好的再生水稻植株炼苗、移栽。
3.8
转基因水稻的
GUS
组织化学检测
具体方法参照
Jefferson
方法
(1987)
所述。
3.9
基因组
PCR
检测
提取除草剂抗性水稻植株的基因组
DNA
(TIANGEN
公司的植物基因组提取试剂盒提取
)
。根
据
UbiI
启动子序列，设计合成一对引物，上游引物
序列为：
5’
-
CATCTCTGTCGCTGCCTCTG
-
3’
；下
游引物序列为：
3’
-
CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA
-
5’
。
PCR
反应体系为
25 µl
，上下游引物各
1.5 µl
，
2 µl
Template DNA
，
2.5 µl 10
×
EX Taq
Buffer
，
4 µl dNTPs
(2.5 mmol/L, Mg
2+
plus)
，
0.15 µl
TaKaRa EX Taq
DNA
聚合酶，
11.35 µl ddH
2
O
。
PCR
扩增程序为：
94
℃
变性
2
分钟，
94
℃
30
秒，
55
℃
40
秒，
72
℃
40
秒，
35
个循环；
72
℃延伸
3
分钟，
4
℃保存。用
1
％琼脂
糖凝胶电泳检测扩增产物。
3.10
统计分析
实验数据使用统计软件
SPSS 13.0
作差异显著
性分析，采用
LSD
法作多重比较分析。
作者贡献
赵德刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计和论
文写作与修改。郭刚参与本研究实验设计、实验研究、数据
分析、论文初稿的写作和试验结果分析。余靖参与完成研究
中载体设计。试验植物材料来源于贵州省农业生物工程重点
实验室。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由科技部国际科技合作项目：基因删除技术在
转基因水稻和油菜上的应用及安全性评价
(
项目编号
:
2007DFA31260)
；科技部国家科技支撑计划项目：喀斯特山
区特有作物优异基因资源发掘与转基因安全关键技术研究
与应用
(
项目编号
: 2007BAD59B06)
；科技部国家科技支撑计
划项目：国家转基因新品种培育重大专项-安全转基因技术
研究
(
项目编号
: 2008ZX08010
-
003)
资助。
参考文献
Cao M.X., Wei Z.M., and Huang J.Q., 2002, Progress on
Transformation of Rice Mediated by
Agrobacterium
Tumefaciens
, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant
Physiology Communications), 38(5): 423-427 (
曹明霞
,
卫志明
,
黄健秋
, 2002,
根癌农杆菌介导的水稻遗传转
化
,
植物学生理学通讯
, 38(5): 423-427)
Clive J., 2010, Global Status of Commercialized Biotech/ GM Crops:
2009, Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi (China
Biotechnology), 30(2): 1-22 (clive james, 2010, 2009
年全球生
物技术／转基因作物商业化发展态势－第一个十四年
1996~2009,
中国生物工程杂志
, 30(2): 1-22)
Duan C.L., Xiao F.H., Carl R., and Lan G., 2001, Establi- shment
of tissue culture system for the transformation of paddy
rice via
Agrobacterium
, Xinan Nongye Daxue Xuebao
(Journal of Southwest Agricultural University), 23(6):
528-531 (
段承俐
,
萧凤回
, Carl Rathus, lan Godwin, 2001,
农杆菌介导转化为目的的水稻组培体系的建立
,
西南农
业大学学报
, 23(6): 528-531)
He C.X., and Xia G.M., 1999, Recent Advances in Gene
Transformation of Monocotyledons Mediated by
Agrobacterium Tumefaciens
, Zhiwuxue Tongbao (Chinese