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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
8
页，共
10
页
加入
500μL 75%
乙醇，洗沉淀，离心
10sec
，弃上
清，自然风干，
DNA
沉淀溶于
50μL
无菌水中。
本研究采用接头
PCR
的方法分离侧翼序列，所
用引物见表
4
。接头
(AD)
制备方法：等体积混合引
物
AD-L (100mM)
和引物
AD-S (100mM)
，最终反应
浓度为
50mM
，在
95%
水浴锅中水浴
10min
，自然
冷却至室温。具体的反应步骤和反应程序如下：第
一步：模板
DNA
的酶切和连接。体系：取用分离
侧翼序列用
CTAB
法分离的模板
DNA
样品
1μL
，
接头
(50mM) 0.2μL
，
10×M buffer 1μL
，
10×T
4
DNA
连接酶
buffer 1μL
，
DraІ (15U/μL) 0.15μL
，
T
4
DNA
连接酶
(10U/μL) 0.2μL
，补
ddH
2
O
水到
10μL
。反应
置于
25
℃
(
室温
)
反应约
16-20h
。
第二步：
PCR
反应第一步。第一步反应产物
1μL
，
10×PCR buffer 2μL
，
2mM dNTPs 1.8μL
，
25mM MgCl
2
1.3μL
，
ADS-1(50mM) 0.5μL
，
3’
端或
5’
端特异引物
(TRB1
或
TosLP1)
，
rTaq DNA
polymerase(Takara
公司
) 0.2μL
，补充
ddH
2
O
到
20μL
。反应程序：
94
℃
4min
；
94
℃
30sec
，
72
℃
3min
，
7cycles
；
94
℃
30sec
，
67
℃
3min
，
32cycles
；
67
℃
7min
；
25
℃
10sec
。
第三步：
PCR
反应第二步。第一步
PCR
反应
产物
1μL
，
10×PCR buffer 2μL
，
2mM dNTPs 1.8μL
，
25mM MgCl
2
1.2μL
，
ADS-2(50mM) 0.5μL
，
3’
端或
5’
端特异引物
(TRB2
或
TosLP2)
，
rTaq DNA
polymerase(Takara
公司
) 0.2μL
，补充
ddH
2
O
到
20μL
。反应程序：
94
℃
4min; 94
℃
30sec, 72
℃
3min,
5cycles; 94
℃
30sec, 67
℃
3min, 35cycles; 67
℃
7min;
25
℃
10sec
。
表
4.
接头
PCR
所用引物
Table 4 The primers used for Adaptor-PCR
引物名称
Primer
用途
Purpose
序列
(5’-3’)
Sequence
AD-L
接头
Adaptor
CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT
AD-S
接头
Adaptor
P-ACCTCCCC-NH
2
ADS-1
接头特异引物
Specific primer for adaptor
GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC
ADS-2
接头特异引物
Specific primer for adaptor
CTATAGCGCTCGAGCGGC
TosLP1
Tos17
左端引物
Left primer
GTGAAAAGGACAGTGGAGCAGTGGATAA
TosLP2
Tos17
左端引物
Left primer
GACCATTGCTCTGATACCATCTTAACTAACTTGC
TRB1
Tos17
右端引物
Right primer
GCATCTTTCACACGTTCTCATTGTCAG
TRB2
Tos17
右端引物
Right primer
CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTG
3.4 Southern
杂交
抽提的水稻样品
DNA5 μg
，采用限制性内切
酶
XbaІ
完全酶切，用
1%TAE
凝胶电泳，然后转移
到尼龙膜上
(Zhang et al., 2007)
。
PCR
反应扩增
Tos17
探 针 的 引 物 为 ：
TosL
：
5'-GCT
ACCCGTTCTTG
GACTAT-3'
；
TosR
：
5'-CTGAAATCGGAGCACTGACA-3'
；探针合成
PCR
反应体系：野生型中花
11
号样品
DNA 5ng,
10×PCR Buffer 2μL, 2mmol/L dNTP 1.5μL,
10μmol/L
引物
0.3μL, 10U/μL Taq
酶
0.2μL
。
PCR
反