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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
7
页，共
10
页
测序效率更是可以达到
90%
，而从左端分离
Tos17
侧翼序列往往存在原始拷贝的公共带，影响侧翼序
列的分离效率。
我们总共获得到非重复的
Tos17
侧翼序列
524
条，通过分析发现
Tos17
的插入位点覆盖在水稻整个
基因组上。就
Tos17
在基因区间的分布而言，
Tos17
倾向于插入基因区间内，不倾向于插入到基因间隔区
和转座子区域，在基因内则比较倾向于插入基因的编
码区，而在基因的编码区内则显著的偏爱于插入基因
的外显子区域。这些特征和
Tos17
在
“
日本晴
”
中的报
道相一致
(Miyao et al., 2003; Piffanelli et al., 2007)
。
同时，这些这些特征在水稻
T-DNA
插入突变体库中
也是类似的
(Zhang et al., 2007)
。
在
2009
年夏季对
1 881
个
T
1
代家系进行了正
向遗传学的筛选，希望从正向遗传学的途径筛选到
与
Tos17
共分离的突变家系。从筛选的结果来看，
田间最主要的突变表型是矮化，突变频率达到
2.23%
，占总突变家系的
38.53%
，其次是育性，不
育突变频率达到
1.17%
，占总突变家系的
20.56%
。
这和日本
NIAS
研究所的筛选结果基本一致，其筛
选的
M
2
代家系中主要的表型也是矮化和不育
(Miyao et al., 2007)
。
而且从田间的表型来看，突
变往往不是只有一个性状，存在两个或三个突变性
状同时发生的现象，例如矮化往往伴随不育或抽穗
期的延迟，叶色变化与株高和穗部突变往往联系在
一起，这说明被插入的基因可能具有一因多效或是
有多个基因被同时敲除掉。从筛选的整个结果来
看，
1 881
个家系中表型突变频率为
5.69%
。而
NIAS
研究所对其
Tos17
突变体进行了表型筛选，发现后
代几乎一半的家系出现了至少一个突变表型。其突
变频率要高于我们的观察结果。其原因可能是：
NIAS
研究所构建的
Tos17
突变体每株中
Tos17
的平
均拷贝数达到
10
个
(Miyao et al.,2007)
，远远高于本
室
Tos17
突变体中的平均拷贝数。
Krysan
等于
1999
年提出了的公式：
P= 1-
(1-x/g)
n
，已被广泛用于计算构建饱和突变体库所需
的标签数目。公式中
X
代表目标作物基因的平均大
小，
G
代表目标作物基因组的大小，
n
代表以一定
概率
P
饱和基因组所需的标签数目。以水稻基因组
大小为
372,000 Kb
，基因的平均长度为
2.8 Kb
来计
算，预计是水稻每一个基因含有标签的概率
99%
需
要得到
561,677
条标签序列。目前在水稻中的突变
体资源已经超过
2 000 000
，侧翼序列的数目也超过
了
200,000
。那么由此产生了一个问题，到底要需
要多少标签能够饱和掉水稻的基因组，即任何一个
基因有
99%
的概率能至少找到一个标签。目前水稻
中的突变体库资源中的插入位点已经超过
2 000
000
已经远远满足饱和水稻基因组的要求，但是水
稻中侧翼序列的数目仅有
200 000
条左右，远远低
于饱和水稻基因组的要求，因此目前比较迫切的任
务是采用更有效的方法分离更多的侧翼序列。新一
代测序技术的出现和发展可能会是给这一难题提
供解决方法
( Mardis, 2008)
。随着测序成本的降低和
测序效率的提升，未来希望能够通过深度测序或其
他方法高效地鉴定标签的插入位点，实现高效剖析
水稻全基因组中功能基因的目的。
3
材料和方法
3.1
Tos17
突变体的产生
将脱壳的野生型中花
11
号种子，于
75%
酒精
中消毒
15min
，
10%HgCl
2
消毒
30min
，转移到诱导
培养基中。待
30
天后愈伤长出，为防止产生的后
代
Tos17
突变体之间有相同的突变位点，所以每一
颗种子诱导出的愈伤仅取一颗转移到继代
N6
培养
基中
(Wu et al., 2003)
，每
30
天更换培养基一次，继
代培养
3
个月。将经过
3
个月继代培养的愈伤转移
到分化培养基中，分化产生
T
0
代突变植株。每一个
愈伤上诱导出的植株只取一株，夏季种于武汉华中
农业大学试验田。
3.2 T
1
代突变体的筛选
2009
年
4
月在华中农业大学实验田播种
Tos17
突变体
T
1
代家系
1,883
个，
5
月
20
日将每个家系随
机取
20
株以
16.5cm×26.4cm
的密度移栽大田，于分
苗期、分蘖期、抽穗期和成熟期四个时期观察表型。
对家系内突变体表型一致的家系进行记载、拍照。
3.3 DNA
抽提和接头
PCR
分离侧翼序列
取水稻新鲜幼嫩片，在
-20
℃
预冷的研钵中磨至
粉末状转入预冷的
2ml
离心管中，加入约半管。每
管加入
600μL 2% CTAB
混合液
(2% CTAB
、
1.4mM
NaCl
、
20mM EDTA
、
100mM Tris-HCl
、
15μL RNA
酶、
0.2% β-
巯基乙醇
)
，上下颠倒摇匀，于
65
℃
水
浴锅中水浴
15min
，
11,000rpm
离心
5min
，吸取上
清约
500μL
。加入等体积的氯仿：异戊醇
(24:1)
，上
下颠倒轻摇
5min
。
11,000rpm
离心
5min
，吸上清
400μL
。加入异丙醇
400μL
，上下颠倒轻摇沉淀
DNA
。离心
5000rpm
，
30sec
沉淀
DNA
，丢弃上清。