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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
9
页，共
10
页
应程序：
94
℃
5min; 94
℃
45sec, 55
℃
45sec, 72
℃
,
1min, 30cycles; 72
℃
, 7min; 25
℃
30sec
。探针长度为
600bp
。
3.5 T
1
代共分离检测
根据侧翼序列的信息在水稻生物信息网站
(http://rice.plantbiology.msu.edu/)
上检索，确定
Tos17
插入的位点，根据插入位点附近的侧翼序列信息，
利用
Premier 5
设计引物，通过
PCR
反应验证插入
位点是否正确。在插入位点两端设计特异引物，通
过一条能和插入位点附近基因组特异匹配的引物
以及一条能和
Tos17
特异匹配的引物配对扩增来确
定插入位点是否正确。如果能配对扩增出特异性条
带，则证明插入位点正确。
PCR
反应在
ABI9700PCR
仪
(Applied Biosystem)
上进行，反应体系如下：模板
DNA 5ng
，
10×PCR Buffer 2μL, 2mmol/L dNTP
1.5μL, 10μmol/L
引物
0.3μL, 10U/μL Taq
酶
0.2μL
。
PCR
反应程序：
94
℃
5min; 94
℃
45sec, 55
℃
45sec,
72
℃
1min, 30cycles; 72
℃
, 7min; 25
℃
30sec
；
Tos17
插入位点两侧设计的
PCR
引物如表
5
所示。
表
5.
Tos17
插入位点两侧设计的
PCR
引物
Table 5 The PCR primers flanking
Tos17
insertion site
引物名称
Primer
序列
(5’-3’)
Sequence
引物名称
Primer
序列
(5’-3’)
Sequence
AD56L
TACTGTCCCCAAATCCAAA
AH77L
GAATAAGGGCAGCGAATG
AD56R
CAACACCAAAGCATATTCCA
AH77R
GGCAAGAATAATAGACGAAATAC
AF4L
GCAAGGTTTATCTGAGTTCC
AH77BL
TGGCTAACGACTTTCACTCA
AF4R
GCAGTTGTGGCAGGTGT
AH77BR
GAATCACGACATTTCTCCCT
AF90L
GTTCAGTTCTATCCAAAATCCC
AM32L
GTTGATGATTTGCTTTGTGC
AF90R
AAGACGACAGGAATGGCTC
AM32R
CTGTGCGTGGATGCTGTA
AF91L
CACCTTCAGACGCAAAACA
AM86L
CTCTTATGCGGAACTATGGC
AF91R
GCCGAACAAACAGAAACG
AM86R
TGGGGATTTCGGGTTG
AF91BL
GTTTCGGACTGCGTCTTC
AO40L
GTGGGAATGTGAAATACGG
AF91BR
TCAATCCACTGCTTGCTTAC
AO40R
AGGAGGGCAGGAAGTGA
AF92L
GTCGTTTTAGGCGTGGCT
AO41L
GAGGTTGGGCTGCTGTT
AF92R
CGTTTTGGAGTCCGTGTT
AO41R
GGATTGTAGATCGGATGAGTAA
作者贡献
本项研究是在吴昌银的指导下完成的。马振参与了突
变体的创建过程，完成数据分析，论文初稿的写作；突变的
田间种植、收种主要由陈国兴完成；吴昌银设计并组织完成
了该项研究，论文修改。全体作者都阅读并同意论文的文本
投稿。
致谢
本研究由国家
863
计划项目
(2006AA10A103)
资助及国
家转基因重大专项课题
(2008ZX08010-002)
资助。作者感谢
李才顺、章成君、曹娟、陈玲、郜新强等人的帮助。
参考文献
Cheng C., Daigen M., and Hirochika H., 2006, Epigenetic
regulation of the rice retrotransposon
Tos17
.
Mol Genet
Genomics
, 276: 378-390
Hirochika H., Guiderdoni E., An G., Hsing Y I., Eun M Y., Han
C D., Upadhyaya N., Ramachandran S., Zhang Q., Pereira
A., Sundaresan V., and Leung H., 2004, Rice mutant
resources for gene discovery.
Plant Mol Biol
, 54:325-334
Hirochika H., Sugimoto K., Otsuki Y., Tsugawa H., and Kanda
M.,1996, Retrotransposons of rice involved in mutations
induced by tissue culture.
Proc Natl Acad Sci USA
, 93:
7783-7788
Jeon J S., Lee S., Jung K H., Jun S H., Jeong D H., Lee J., Kim
C., Jang S., Yang K., Nam J., An K., Han M J., Sung R J.,
Choi H S., Yu J H., Choi J H., Cho S Y., Cha S S., Kim S
I., and An G., 2000, T-DNA insertional mutagenesis for
functional genomics in rice.
Plant J
, 22: 561-570