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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
9
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.9
http://mpb.
5th
.sophia
p
ublisher.com
第
6
页，共
10
页
表
3.
Tos17
插入位点和检测结果
Table 3 Examination of the Tos17 insertional site in different lines
家系名称
Accession No.
插入位点
Insertion site
插入方向
Orientation
验证引物
Primers
结果
Result
08Z11AF4
Chr3: 26985271
正向
Forward
TRB1+AF4R
正确
Correct
08Z11AF90
Chr3: 25579090
反向
Reverse
TRB1+AF90R
错误
Fault
08Z11AF91
Chr3: 9518768
正向
Forward
TRB1+AF91R
正确
Correct
Chr3: 9538658
正向
Forward
TRB1+AF91BRR
正确
Correct
08Z11AF92
Chr1: 35432225
反向
Reverse
TRB1+AF92R
正确
Correct
08Z11AD56
Chr9:22509508
正向
Forward
TRB1+AD56R
正确
Correct
08Z11AH77
Chr10:16761328
反向
Reverse
TRB1+AH77R
正确
Correct
Chr1:39289229
正向
Forward
TRB1+AH77BR
错误
Fault
08Z11AO40
Chr6:4787186
正向
Forward
TRB1+AO40R
正确
Correct
08Z11AO41
Chr3:35554918
反向
Reverse
TRB1+AO41R
正确
Correct
08Z11AM31
Chr4:22402453
反向
Reverse
TRB1+AM31R
正确
Correct
08Z11AM86
Chr4: 20551763
正向
Forward
TRB1+AM86R
正确
correct
图
6
Tos17
在基因
LOC_Os06g09430
中的插入位点以及
PCR
验证结果
注
: A:
Tos17
插入位点示意图
; B: PCR
扩增验证结果
,
左边泳
道为
DNA Marker (5000bp, 3000bp, 2000bp, 1000bp, 750bp,
500bp, 250bp, 100bp);
泳道
1-7
为家系
08Z11AO40
的
T1
代植
株
Tos17
在基因
LOC_Os06g09430
位点的检测结果
(
配对引物
为
TRB1
和
AO40R), CK,
中花
11
号作为阴性对照
Figure 6 Verification of the insertion of
Tos17
on the gene
LOC_Os06g09430
Note: A: Insertion site of
Tos17
on the gene LOC_Os06g09430;
B: Left line indicates the Tran2K plus DNA Marker (5000bp,
3000bp, 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp); Line
1-7 indicate the result of PCR amplification of the progeny of
08Z11AO40 with the primers of TRB1and AO40R, CK
indicate the negative control with Zhonghua 11 sample
2
讨论
接头
PCR
由于涉及酶切连接的过程，因此对于
模板
DNA
的质量有很高的要求，同时对于限制性
内切酶的选择很重要。由于在水稻基因组中存在
Tos17
的原始拷贝，因此接头
PCR
的体系和设计需
要满足不能将原始拷贝附近的基因组序列扩出的
要求。对于水稻品种
“
日本晴
”
，两个原始拷贝附近
的基因组序列酶切位点分析表明，
Dra
І
更适合分离
Tos17
侧翼序列，因为
“
日本晴
”
的中的两个
Tos17
原始拷贝的右端的
Dra
І
酶切位点据这两个
Tos17
原
始拷贝的右端边界的距离都在
1.8kb
以上，而所用
的接头
PCR
中进行巢式
PCR
扩增的反应程序很难
将
2kb
以上的片段扩出，这样分离出的
Tos17
侧翼
序列即为新插入位点的侧翼序列。对于中花
11
号，
经过摸索我们认为
Xba
І
和
Dra
І
这两种酶比较适合
用于进行接头
PCR
反应。同样我们还在据
Tos17
左
边界
200bp
左右设计了从
Tos17
左端进行巢式
PCR
扩增的
Tos17
特异引物，从而比较从不同方向分离
Tos17
侧翼序列的效率。实验证明，从
Tos17
右端
分离侧翼序列
PCR
扩增效率可以达到
60%
以上，