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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
3
页
1.3 EST-PCR
产物的混合克隆测序
在
8
个、
16
个、
24
个和全部
32
个
EST-SSR
对
细叶桉
P
2
扩增产物的混合克隆测序中，测序成功的
标记数分别为
6
个
(75.0%)
、
11
个
(68.8%)
、
11
个
(45.8%)
和
14
个
(43.8%) (
表
1)
。可见，随着混合克隆的
EST-PCR
产物数量的增加，虽然测序成功的标记数
量呈增加的趋势，但比例却逐渐下降。其中，
16
个
PCR
产物混合克隆的成功测序的标记数量较大、比
例也较高。不同数量
PCR
产物混合克隆共成功测序
19
个标记
(
表
1)
。与
PCR
产物直接测序相比，有
6
个标记
(15
、
16
、
26
、
27
、
29
和
30
号
)
只在混合克隆
测序中被测到，包括
2
个片段长度杂合标记
(15
和
29
号
)
和
1
个长度纯合、含有个体内
SNP
的标记
(26
号
)
；
但有
8
个
PCR
产物直接测序成功的标记
(5
、
9
、
10
、
11
、
14
、
17
、
18
和
19
号
)
在混合克隆后没有被测到。
图
1
桉树
32
对
EST-SSR
引物对
1
株细叶桉
(P
2
)
的
PCR
扩增产物
注
: 01~32: EST-SSR
引物
(
见表
1)
；
M: 100bp DNA ladder
Figure 1 PCR products amplified from the tested
Eucalyptus tereticornis
individual (P
2
) using 32 EST-SSR primer pairs
Note: 01
∼
32: EST-SSR primer pairs (see Table 1); M: 100bp DNA ladder
图
2
在
P
2
中片段长度纯合的标记
EUCeSSR1135 (06
号
)
的部分序列及其与源
EST
的对比
注
:
阴影部分的序列为
EST-SSR
的重复单位
Figure 2 Partial sequences of the length-homozygous EST-SSR marker EUCeSSR1135 (No. 06) within P
2
and their comparison to
the original EST
Note: The bases in grey shadow show the repeat motif of the EST-SSR marker within P
2
混合克隆的单菌落测序的峰图比较
“
干净
”(
图
3B
和
C)
，有利于查找
SSR
的位置和数量；但对于
长度杂合的
EST-SSR
标记，单菌落测序只能测到一
个等位片段。本研究中，由于有的杂合标记参加了
不同数量的
PCR
产物混合克隆，刚好不同的等位片
段均被测序，如
8
、
13
、
20
、
22
和
29
号
(
表
1)
。
混合克隆测序中也发现了一些
“
误扩增
”
片段，
即引物序列同某一个
EST
，但序列的长度与相应的
PCR
产物不同、且与源
EST
的序列一致性很低。该
类片段可能为非特异性扩增所致，因长度刚好类似