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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
2
页
780
万公顷以上
(FAO, 2000)
。
简单序列重复
(simple sequence repeats, SSR)
，
或称微卫星，在基因组中数量众多，作为分子标记
具有重复性好、共显性和变异性高等特点
(Tauz,
1989; Powell et al., 1996)
，在生物学有关研究中应用
广泛
(
方宣钧等
, 2001)
。目前，桉树上已开发的
SSR
标记相对较少，包括
367
个基因组
SSRs (Brondani et
al., 2006)
、
35
个叶绿体
SSRs (Steane et al., 2005)
和
20
个表达序列标签
(expressed sequence tag, EST)
SSRs
，或称
EST-SSR(Faria et al., 2010)
。其中，
EST-SSR
因与基因相关，在近缘物种中的通用性较
高
(Varshney et al., 2005; Ellis and Burke, 2007)
，与
功能基因的连锁不平衡也可能较强
(Ayers et al.,
1997)
。公共数据库中日益增多的
EST
序列也为
EST-SSR
开发提供了便利。截止
2010
年
7
月
12
日
GenBank
中已 有桉属
EST
序列
37 751
条
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/?term=Eucalypt
us)
。分析表明，桉属
EST
序列约
15%
含有
SSR (
李
淑娴等
, 2010)
，非冗余
EST
序列中
25%
以上含有
SSR (Rabello et al., 2005; Ceresini et al., 2005)
。
虽然，在许多物种中开展了
EST-SSR
标记开发
研究，但极少确认聚合酶链式反应
(polymerase chain
reaction, PCR)
产物与源
EST
序列的一致性。据我们
所知，只有
3
篇报道进行了部分
EST-SSRs
的序列
确认，包括鹰嘴豆
(
Cicer arietinum
L.) 60
个
EST-SSR
标记中的
5
个
(Choudhary et al., 2009)
、生
菜
(
Lactuca sativa
L.) 61
个标记中的
30
个
(Simko,
2009)
和茶树
(
Camellia sinensis
L.) 61
个标记中的部
分标记
(Sharma et al., 2009)
。由于引物的低特异性可
能导致
PCR
错误扩增，从而产生非目的片段或假阳
性片段
(Cha and Thilly, 1995; Kunkel and Bebenek,
2000;
张晓红等
, 2009)
，因此，对于包括
SSR
在内
的序列标签位点
(sequence tagged site, STS)
的序列
确认是非常必要的。
PCR
产物一般可以通过两种方法测序，即直接
测序和克隆后的菌落测序。前者操作上相对快捷，
但当
PCR
产物不纯时测序结果较难判读
(
张晓红等
,
2009)
；后者针对单菌落测序，模板单一，可以获得
理想的测序结果，尤其是可以获得
PCR
产物的完整
序列，但需要进行克隆转化，增加了实验的成本以
及工作量。因此，如何选择合适的测序方案以保障测
序质量、控制实验成本和提高实验效率，是
EST-SSR
标记开发和其它
PCR
产物测序的一个关键问题。
本研究以
1
株细叶桉
(
E. tereticornis
Smith)
为材
料，比较了桉树
EST-SSR
标记开发中
PCR
产物直
接测序和混合克隆测序的效果，以期获得高效、经
济的
EST-PCR
产物测序方案。同时，开发了一批桉
树
EST-SSR
标记，有助于增加桉树的分子标记资源。
1
结果与分析
1.1
桉树
32
对
EST-SSR
引物的
PCR
扩增
为了在混合克隆后可以通过单菌落
PCR
产物
查找长度对应的
EST-PCR
产物，并且避免对插入片
段相同、菌落
PCR
产物长度亦同的菌落的重复测
序，候选
32
对桉树
EST-SSR
引物对
1
株细叶桉
(P
2
)
DNA
扩增的产物大小尽量不同，介于
120 bp
和
1
500 bp
之间
(
图
1)
。
PCR
产物基本都是单一、明亮
的谱带，少量
PCR
产物具有较弱的杂带
(
图
1
中
27
、
29
和
31
号
)
。另外，
32
对
EST-SSR
引物中，有的
PCR
产物大小与设计的
EST
长度相符，有的明显大
于设计的
EST
长度
(
表
1)
。
1.2
桉树
32
对
EST-SSR
引物的
PCR
产物的直接测序
32
个
EST-SSR
对
P
2
的
PCR
产物直接测序中，
成功测序的有
21
个
(
表
1)
，比例为
65.6%
。其中，
4
个
EST-SSR (03
、
08
、
20
和
22
号
)
的简单重复序列
邻近测序引物，未能确认完整的重复单位数，因毛
细管测序中引物序列后一般有
30
∼
40 bp
不能测出。
成功测序的
21
个
EST-SSR
中，
P
2
的
2
个等位片段
间在长度上纯合的标记有
13
个，杂合的有
8
个
(08
、
11
、
13
、
17
、
18
、
20
、
22
和
28
号
)
，其中
18
号的
杂合性是由于单个碱基重复数的变异所致
(
表
1)
。对
于长度杂合的
SSR
标记，
PCR
产物直接测序峰图中
重复单位变异后出现双峰
(
单峰也是双峰叠加的结
果
)
。图
2
和图
3A
分别显示了
P
2
中等位片段长度纯
合标记
EUCeSSR1135 (06
号
)
和杂合标记
EUCeSSR-
0946 (13
号
)
的重复单位及其与源
EST
的对比。
另外，片段长度纯合的
13
个标记中，有
7
个
(02
、
03
、
04
、
05
、
10
、
14
和
23
号
)
在
P
2
的
2
个等位片段
间存在至少
1
个单核苷酸多态性
(single nucleotide
polymorphism, SNP)
，或称个体内
SNP
。